Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen
Summary
Recente vooruitgang in het vermogen om somatische cellijnen genetisch te manipuleren, biedt een groot potentieel voor basis en toegepast onderzoek. Hier presenteren wij twee benaderingen voor CRISPR / Cas9 gegenereerde knockout productie en screening in zoogdiercellijnen, met en zonder het gebruik van selecteerbare markers.
Abstract
Het CRISPR / Cas9 genoom engineering systeem heeft de biologie revolutionair gemaakt door het mogelijk te maken voor nauwkeurige genoom-editing met weinig moeite. Geleid door een enkele gids RNA (sgRNA) die specificiteit verleent, klooft het Cas9-eiwit beide DNA-strengen op de target locus. De DNA-pauze kan zowel niet-homologe eindverbindingen (NHEJ) of homologiregerichte reparatie (HDR) veroorzaken. NHEJ kan kleine deleties of invoegingen introduceren die tot frame-shift mutaties leiden, terwijl HDR mogelijk maakt voor grotere en nauwkeuriger storingen. Hier presenteren wij protocollen voor het genereren van knock-out-cellijnen door koppeling van gevestigde CRISPR / Cas9 methoden met twee opties voor downstream selectie / screening. De NHEJ-aanpak maakt gebruik van een enkele sgRNA-cut-site en selectie-onafhankelijke screening, waarbij eiwitproductie wordt beoordeeld op dot-immunoblot op een hoge doorvoerwijze. De HDR-aanpak gebruikt twee sgRNA-cut-sites die het gen van belang richten. Samen met een voorziene HDR-sjabloon kan deze methode worden verwijderdVan tientallen kb, ondersteund door de ingevoegde selecteerbare weerstandsmelder. De passende toepassingen en voordelen van elke methode worden besproken.
Introduction
Stabiele genetische veranderingen bieden een voordeel ten opzichte van transiënte methoden van cellulaire perturbatie, die in hun efficiëntie en duur variabel kunnen zijn. Genomische bewerking is de laatste jaren steeds vaker geworden door de ontwikkeling van doelspecifieke nucleasen, zoals zinkvinger nucleasen 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs) 6 , 7 , 8 , 9 En RNA-geleidende nucleasen afgeleid van het geclusterde, regelmatige interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) systeem 10 .
De CRISPR / Cas9-bewerkingsmachines zijn aangepast aan een immuunsysteem dat bacteriën en archea gebruiken om te beschermen tegen virale infectiesAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . In dit proces worden korte 20-30 nt-fragmenten van invallende virale sequentie opgenomen in een genomische locus als "spacers", geflankeerd door herhaling van eenheden 14 , 15 . Opvolgende transcriptie- en RNA-verwerking genereert kleine CRISPR-geassocieerde RNA's 16 (crRNAs) die samen met een trans-activerende crRNA 17 (tracrRNA) samenstellen met het effector Cas9 endonuclease. De crRNA's verschaffen derhalve specificiteit voor Cas9-targeting, het begeleiden van het complex om complementaire virale DNA-sequenties te kloppen en verdere infecties 18 , 19 te voorkomen. Elke "protospacer" -sequentie in het geteikende DNA kan dienen als de bron van het crRNA, zolang het direct 5 'is naar een kort protospacer naburig motief (PAM), NGG in het geval van S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. De afwezigheid van de PAM-sequentie in de buurt van het spacer in de gastheer CRISPR locus onderscheidt zichzelf en niet-zelf, waardoor het voorkomen van de gastheer wordt voorkomen. Vanwege zijn universaliteit en flexibiliteit is dit biologische systeem krachtig aangepast voor genomische bewerking, zodat bijna elke PAM-aangrenzende DNA-site kan worden gericht. In deze versie versmelt een verdere wijziging van het crRNA en tracrRNA in een enkelvoudige RNA-component (sgRNA) die in het Cas9-eiwit 21 geladen is.
Bij expressie van Cas9 en een sgRNA in eukaryote cellen, splitst het Cas9-eiwit beide DNA-strengen op de gerichte locus. Bij afwezigheid van een geschikt gebied van homologe sequentie fixeert de cel deze pauze via niet-homologe eindverbindingen (NHEJ) 22 , 23 , 24 , die typisch kleine deleties of zelden invoegingen introduceren. Wanneer u een open doel richtLeestraject leidt de reparatie waarschijnlijk tot een translationele frameshift die een niet-functioneel eiwitproduct produceert. In tegenstelling, wanneer deze wordt voorzien van een exogeen sjabloon met grote gebieden van homologie, kan de cel de dubbelstrengpauze repareren door homologie gerichte reparatie 25 , 26 . Deze route zorgt voor grotere nauwkeurige deleties, vervangingen of invoegingen in het genoom, gekoppeld aan de introductie van excisabele selectiemarkeringen 27 .
Hier presenteren we protocollen voor het genereren van knock-out cellijnen door middel van een van deze twee CRISPR / Cas9 methoden ( Figuur 1A ). De NHEJ-aanpak maakt gebruik van een enkele sgRNA-cut-site en selectie-onafhankelijke screening, en vereist dus een beetje voorafgaande voorbereiding. Als u deze methode gebruikt, leid u RNA's die complementair zijn met exons in de buurt van het 5'-uiteinde van het transcript, dat waarschijnlijk een knock-out zal produceren, ontworpen moeten worden. Sinds de modificatIonen in het genoom in dit geval zijn klein, screening voor knock-out klonen is gebaseerd op dot blots, waar het eiwit product wordt beoordeeld op een high-throughput manier. We gebruiken de generatie van ELAV-achtige 1-eiwit (ELAVL1) knock-out lijnen als voorbeeld. De tweede aanpak is gebaseerd op homologie gerichte reparatie (HDR) en maakt gebruik van twee sgRNA-cut-sites die het gen of gebied van belang richten, waardoor er tientallen kb's kunnen worden verwijderd. Een plasmide met twee gebieden van homologie die de splitsingsplaatsen flankert, verschaft een vervangende sjabloon ( Figuur 1B ), waarbij een selecteerbare weerstandsmerker wordt geïntroduceerd die de efficiëntie van knock-out generatie verhoogt. Deze methode kan ook worden aangepast om genmodificaties te introduceren met goed ontworpen homologie armen. In dit geval zorgt de integratie van een nieuw DNA fragment voor PCR-gebaseerde screening ( Figuur 1C ). Hier gebruiken we de generatie van Pumilio RNA bindende familielid 2 (PUM2) knock-out lijnen als voorbeeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het CRISPR / Cas9-systeem heeft de mogelijkheid tot efficiënte generatie van stabiele genomische modificaties mogelijk, die een meer consistent alternatief bieden voor andere transiënte manipulatiemethoden. Hier hebben wij twee methoden voor de snelle identificatie van CRISPR / Cas9 gen-knockouts in zoogdiercellijnen voorgesteld. Beide methoden vereisen weinig cellulair materiaal, zodat het testen in vroege stadia van klonale cultuur kan worden gedaan, waardoor tijd en reagentia bespaard kunnen worden. Om de efficiën…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Gissell Sanchez, Megan Lee en Jason Estep voor experimenteel hulp, en Weifeng Gu en Xuemei Chen erkennen voor het delen van reagentia.
Materials
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Génétique. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
- Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Génétique. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Génétique. 186 (2), 757-761 (2010).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
- Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
- Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
- Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Génétique. 196 (4), 961-971 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
