Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen
Summary
Jüngste Fortschritte in der Fähigkeit, somatische Zelllinien genetisch zu manipulieren, haben großes Potenzial für grundlegende und angewandte Forschung. Hier präsentieren wir zwei Ansätze für CRISPR / Cas9-produzierte Knockout-Produktion und Screening in Säugetierzelllinien, mit und ohne Verwendung von selektierbaren Markern.
Abstract
Das CRISPR / Cas9 Genom Engineering System hat die Biologie revolutioniert, indem es genaue Genombearbeitung mit wenig Aufwand ermöglicht. Geleitet von einer einzigen Guide-RNA (sgRNA), die Spezifität verleiht, spaltet das Cas9-Protein beide DNA-Stränge am Zielort. Der DNA-Bruch kann entweder nicht-homologe Endverbindungen (NHEJ) oder Homologie gerichtete Reparatur (HDR) auslösen. NHEJ kann kleine Deletionen oder Insertionen einführen, die zu Frame-Shift-Mutationen führen, während HDR größere und präzisere Störungen ermöglicht. Hier präsentieren wir Protokolle zur Erzeugung von Knockout-Zelllinien durch Kopplung von etablierten CRISPR / Cas9-Methoden mit zwei Optionen für die nachgeschaltete Auswahl / Screening. Der NHEJ-Ansatz nutzt eine einzelne sgRNA-Cut-Stelle und selektionsunabhängiges Screening, bei der die Proteinproduktion durch Dot-Immunoblot in einer Hochdurchsatz-Weise beurteilt wird. Der HDR-Ansatz verwendet zwei sgRNA-Cut-Stellen, die das Gen von Interesse überspannen. Zusammen mit einer bereitgestellten HDR-Vorlage kann diese Methode eine Löschung erreichenVon zehn kb, unterstützt durch die eingefügte wählbare Widerstandsmarkierung. Die entsprechenden Anwendungen und Vorteile jeder Methode werden diskutiert.
Introduction
Stabile genetische Veränderungen bieten einen Vorteil gegenüber transienten Methoden der zellulären Störung, die in ihrer Effizienz und Dauer variabel sein können. Die genomische Bearbeitung ist in den letzten Jahren aufgrund der Entwicklung von zielspezifischen Nukleasen, wie z. B. Zinkfinger-Nukleasen 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALENs) 6 , 7 , 8 , 9 immer häufiger geworden Und RNA-geführte Nukleasen, die aus dem geclusterten, regelmäßig verteilten kurzen palindromischen Wiederholungssystem (CRISPR) 10 gewonnen wurden .
Die CRISPR / Cas9-Bearbeitungsmaschinen werden von einem Immunsystem angepasst, das Bakterien und Archaea zur Verteidigung gegen Virusinfektionen verwendenAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . In diesem Prozess werden kurze, 20-30 nt-Fragmente der eindringenden Virussequenz in einen genomischen Locus als "Spacer" eingebaut, die von den Wiederholungseinheiten 14 , 15 flankiert sind. Nachfolgende Transkriptions- und RNA-Verarbeitung erzeugt kleine CRISPR-assoziierte RNAs 16 (crRNAs), die zusammen mit einer transaktivierenden crRNA 17 (tracrRNA) mit der Effektor-Cas9-Endonuklease zusammensetzen. Die crRNAs bieten somit eine Spezifität für das Cas9-Targeting, die den Komplex leitet, um komplementäre virale DNA-Sequenzen zu spalten und weitere Infektionen zu verhindern 18 , 19 . Jede "Protospacer" -Sequenz in der Ziel-DNA kann als Quelle der crRNA dienen, solange sie direkt 5 'zu einem kurzen Protospacer benachbarten Motiv (PAM), NGG im Fall von S. pyogenes Cas9 ist <sUp class = "xref"> 20 Die Abwesenheit der PAM-Sequenz nahe dem Spacer im CRISPR-Locus des Hosts unterscheidet zwischen Selbst und Nicht-Selbst und verhindert das Targeting des Hosts. Wegen seiner Universalität und Flexibilität ist dieses biologische System mächtig für die genomische Bearbeitung angepasst worden, so dass nahezu jede PAM-benachbarte DNA-Stelle gezielt werden kann. In dieser Version fusionierte eine weitere Modifikation die crRNA und tracrRNA zu einer einzigen RNA (sgRNA) -Komponente, die in das Cas9-Protein 21 geladen wurde.
Bei der Expression von Cas9 und einer sgRNA in eukaryotischen Zellen spaltet das Cas9-Protein beide DNA-Stränge am Zielort. In Abwesenheit einer geeigneten Region der homologen Sequenz fixiert die Zelle diesen Bruch über eine nicht homologe Endverbindung (NHEJ) 22 , 23 , 24 , die typischerweise kleine Deletionen oder selten Insertionen einführt. Bei der Ausrichtung auf eine offeneLeserahmen, führt die Reparatur wahrscheinlich zu einer translationalen Frameshift, die ein nicht-funktionelles Proteinprodukt produziert. Im Gegensatz dazu kann die Zelle, wenn sie mit einer exogenen Schablone mit großen Regionen der Homologie versehen ist, die doppelsträngige Pause durch homologisch gerichtete Reparatur 25 , 26 fixieren. Dieser Weg ermöglicht größere präzise Deletionen, Ersetzungen oder Insertionen im Genom, gepaart mit der Einführung von ausfahrbaren Selektionsmarkern 27 .
Hier stellen wir Protokolle zur Erzeugung von Knockout-Zelllinien durch eine dieser beiden CRISPR / Cas9-Verfahren vor (Abbildung 1A ). Der NHEJ-Ansatz nutzt eine einzelne sgRNA-Cut-Site und selektionsunabhängiges Screening und erfordert daher eine geringe Vorwärtspräparation. Bei der Verwendung dieser Methode müssen RNAs, die komplementär zu Exons in der Nähe des 5'-Endes des Transkripts sind, die am ehesten ein Knockout produzieren, entworfen werden. Seit dem modifikatIonen zum Genom in diesem Fall sind klein, das Screening auf Knockout-Klone basiert auf Punkt-Blots, wo das Protein-Produkt in einer Hochdurchsatz-Weise beurteilt wird. Wir verwenden die Generation von ELAV-ähnlichen 1 Protein (ELAVL1) Knockout Linien als Beispiel. Der zweite Ansatz beruht auf homologisch gerichteter Reparatur (HDR) und verwendet zwei sgRNA-Cut-Stellen, die das Gen oder die Region von Interesse überspannen, was eine Deletionen von zehn kb ermöglicht. Ein Plasmid mit zwei Regionen der Homologie, die die Spaltstellen flankieren, liefert eine Ersatzschablone (Abbildung 1B ), die einen wählbaren Resistenzmarker einführt, der die Effizienz der Knockout-Erzeugung erhöht. Diese Methode kann auch angepasst werden, um Genmodifikationen mit richtig entworfenen Homologiearmen einzuführen. In diesem Fall ermöglicht die Integration eines neuen DNA-Fragments ein PCR-basiertes Screening (Abbildung 1C ). Hier verwenden wir die Generierung von Pumilio RNA Bindung Familienmitglied 2 (PUM2) Knockout Linien als Beispiel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das CRISPR / Cas9-System ermöglicht eine effiziente Erzeugung stabiler genomischer Modifikationen, die eine konsistentere Alternative zu anderen transienten Manipulationsverfahren bieten. Hier haben wir zwei Methoden zur schnellen Identifizierung von CRISPR / Cas9-Gen-Knockouts in Säugetierzelllinien vorgestellt. Beide Methoden erfordern wenig zelluläres Material, so dass Tests in frühen Stadien der Klonalkultur durchgeführt werden können, spart Zeit und Reagenzien. Um die Effizienz beider Methoden zu erhöhen, em…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Gissell Sanchez, Megan Lee und Jason Estep für experimentelle Hilfe und Weifeng Gu und Xuemei Chen für den Austausch von Reagenzien anerkennen.
Materials
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
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