Een capillair gebaseerde-immunoassay met een commercieel platform om te meten doel eiwitten uit totaal eiwit preparaten wordt aangetoond. Daarnaast zijn assay parameters van blootstellingstijd, eiwitconcentratie en verdunning van de antilichamen geoptimaliseerd voor een model van de celcultuur.
Nieuwe technologieën die gebruikmaken van de capillaire gebaseerde immunoassay beloven eiwit sneller en meer kwantitatieve beoordeling ten opzichte van traditionele immunoassay. Gelijkaardig aan andere testen antilichaam gebaseerde eiwit, optimalisatie van capillaire gebaseerde immunoassay parameters, zoals de eiwitconcentratie, antilichaam verdunning en de blootstellingstijd is echter een belangrijke voorwaarde voor het genereren van zinvolle en betrouwbaar gegevens. Metingen moeten vallen binnen de lineaire reeks van de test waar veranderingen in signaal zijn recht evenredig met de veranderingen in de concentratie van de lysate. Het proces van het kiezen van de juiste lysate concentraties, antilichaam verdunningen en blootstelling tijden in de menselijke bronchiale epitheliale cellijn, BEAS-2B, is hier aangetoond. Assay lineariteit wordt weergegeven over een aantal hele cel extract eiwit concentraties met p53 en α-tubuline antilichamen. Een voorbeeld van signaal burnout is te zien op de hoogste concentraties met lange belichtingstijden en een α-tubuline antilichaam verdunning kromme wordt weergegeven met het aantonen van verzadiging. Daarnaast worden voorbeeld experimentele resultaten gerapporteerd voor Doxorubicine behandelde cellen met behulp van geoptimaliseerde parameters.
Capillaire elektroforetische immunoassay eiwit expressie in de cel lysates met behulp van grootte of heffing scheiding systemen meten en bieden verschillende voordelen ten opzichte van de traditionele immunoassay. Bijvoorbeeld, in vergelijking met westelijke vlek, de geautomatiseerde capillair gebaseerde procedure elimineert de noodzaak voor gels, transfer devices, en handleiding wast. Bovendien, is de absolute hoeveelheid eiwit nodig ongeveer 10 keer minder, waardoor capillaire gebaseerde systemen ideaal voor gebruik met zeldzame celtypes of beperkte steekproef1,2. Resultaten worden verkregen in zo weinig als 3 h met gebruikmaking van geautomatiseerde systemen en hebben eerder aangetoond meer kwantitatieve en reproduceerbare dan conventionele westelijke vlek procedures3,4,5. Het proces voor de grootte gebaseerde testen bestaat uit het laden van de monsters met natrium dodecyl sulfaat (SDS), dithiothreitol (DTT), en fluorescently label molecuulgewicht markeringen in capillaire kolommen met stapelen en scheiding matrices. Spanning toegepast op de haarvaten scheidt de eiwitten in de monsters volgens grootte en UV-licht ummobiliseerd de gescheiden eiwitten van de capillaire wanden. Het capillair is dan immuno-gesondeerd met doelgroepen gerichte primaire antilichaam en horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam. Luminol en peroxide katalyseren chemiluminescentie lichte generatie die is gemeten door een lading gekoppelde apparaat (CCD) camera en geanalyseerd om te kwantificeren van eiwit.
Ondanks de relatief gemak en de snelheid van een geautomatiseerde capillair gebaseerde elektroforetische immunoassay platform is optimalisatie van assay voorwaarden zoals eiwitconcentratie, antilichaam verdunning en de blootstellingstijd belangrijk voor het verkrijgen van nauwkeurige en reproduceerbare resultaten. In het algemeen moeten de volgende procedures voor het optimaliseren van een assay voor deze systemen worden uitgevoerd:
1) een scherm moet worden uitgevoerd om te evalueren en kies antilichamen voor signaal en specificiteit naar het doel van het eiwit. Indien beschikbaar, kan gezuiverde eiwit of doel epitoop worden gebruikt voor het beoordelen van specificiteit; het is echter nog steeds belangrijk voor het beoordelen van mogelijke niet-specifieke signaal in totaal eiwit afkomstig uit de modelsysteem.
2) vervolgens moet het dynamisch bereik van de bepaling worden vastgesteld. In een ideale situatie, wordt signaal verdubbeling (gemeten met behulp van piekoppervlakte) waargenomen als monster concentratie is verdubbeld; echter in de praktijk is een evenredige wijziging in signaal om in te voeren op een voorspelbare wijze (bijvoorbeeldlineaire passen) voldoende voor eiwit kwantificering. Bovendien, zal deze optimalisatie eiwitconcentratie met hoog signaal maar nog steeds binnen het lineaire bereik voor de experimentele model bepalen.
3) Bepaal de concentratie van de optimale antilichaam met behulp van de vaste eiwitconcentratie gekozen in stap 2 van de optimalisatie. Aangezien de antilichaam-concentratie stijgt, loopt het signaal op tot het randplateau bij verzadiging. De concentratie van een antilichaam in de buurt van deze saturatie niveau is vereist voor nauwkeurige meting van de eiwitconcentratie.
Het proces waarmee eiwit concentraties, antilichaam verdunningen en blootstelling tijden voor een geautomatiseerde capillair gebaseerde grootte assay6 optimaliseren is aangetoond door middel van de hele cel extracten van BEAS-2B, een SV-40 getransformeerd mens bronchiale geïsoleerd epitheliale cellijn. Eiwit isolatie van extracten van de cel of het weefsel kan worden uitgevoerd met behulp van een aantal gepubliceerde protocollen7,8,9 en worden hier niet behandeld. Uitkomsten van een proef experiment met de geoptimaliseerde voorwaarden worden ook gemeld voor totaal en phosphorylated (serine 15, serine 20) p53 in culturen blootgesteld aan Doxorubicine (een gemeenschappelijk chemotherapeutische agent die cel apoptosis10 induceert) 1.2, 1.8, en 2.4 µg/mL media voor 4 h voorafgaand aan de oogst. De p53 piek gebieden zijn genormaliseerd naar ɑ-tubuline, die wordt gebruikt als een besturingselement laden.
Voor decennia, er is aanhoudende belangstelling voor de ontwikkeling van capillaire elektroforetische gebaseerde immunoassay methoden vanwege lage monster en reagens uitgaven, daalde verwerking tijd in vergelijking met traditionele methoden, en hoge compatibiliteit met automatiseren van de procedure4,15. Er zijn een aantal verschillende protocollen voor de scheiding van proteïnen toe die hebben gebruikt haarvaten, inclusief elektroforetische, elektrokinetische, polymeer zeven en elektrisch methoden, die eiwitten (respectievelijk door verschillende eigenschappen isoleren, elektrostatische lading, partitie evenwicht, zeven eigenschappen van de scheitrechter matrix, en pH)16. Hier beschrijven we een antilichaam-gebaseerd (of immunoassay) capillaire elektroforese methode, met behulp van een polymeer zeven scheiding, die is geautomatiseerd en commercieel aangenomen3. Voordelen van dit systeem zijn gebruiksgemak en bewerking, gestandaardiseerde en verkrijgbare reagentia, en betrouwbare, gevoelige metingen die minder reagens en monsters in vergelijking met traditionele eiwit assays zoals westelijke vlek, vereisen Enzyme-linked immunoassay, en andere formaten3,4,5. Er wordt opgemerkt in eerdere evaluaties van deze technologie dat de groottewaaier van eiwit dat kan worden beoordeeld heeft is beperkt door de beschikbare scheiding matrix4, maar recente aanbod hebben uitgebreid de meetbare variëren van 2 tot 440 kDa17 . Bovendien, dat sommige lysate buffers zitten bekend voor zitten onverenigbaar is met de assay18, dan ook moet selectie van de experimentele gebruikte reagentia beschouwd vooraf.
Een groot voordeel van een geautomatiseerde procedure met verkrijgbare componenten is consistentie van resultaten door middel van gestandaardiseerde methoden en reagentia. Dit minimaliseert kansen van assay mislukking door het automatiseren van kritische stappen binnen de procedure. Het is echter belangrijk op te merken dat bepaalde praktijken tijdens het protocol tot een minimum beperken van problemen met de capillaire elektroforetische gebaseerde immunoassay moeten worden nageleefd. Ten eerste is het essentieel dat het luminol-S/peroxide mengsel bereid is fris en onmiddellijk voordat de plaat geladen. Consistente timing zal resulteren in consistente luminescentie nadat de oxiderende agent is toegevoegd, die in een consistente metingen voor een bepaald antilichaam assay na assay resulteren zal. Het is bovendien belangrijk dat niet-verlopen reagentia worden gebruikt, die vooral van invloed is op de potentie van de oxiderende agent. Daarnaast is het belangrijk dat de volgorde van laden van monsters, antilichamen en andere reagentia strikt worden gevolgd (Zie Figuur 1). Elk reagens afgepipetteerde misplaatst zal resulteren in assay falen en een verspilde run.
Naast deze kritische stappen, kunnen de primaire problemen ervaren met de techniek in het algemeen dankzij optimalisatie worden overwonnen. Inderdaad, deze voorwaarden zijn specifiek voor elk model systeem/antilichaam combinatie en daarom moeten empirisch worden bepaald voor elke nieuwe assay. In dit artikel focussen we op drie gemeenschappelijke optimalisatie procedures: belichtingstijd, lysate titratie en primair antilichaam verdunning. De mogelijkheid om meetbare resultaten te genereren, is afhankelijk van analyse van een blootstellingstijd wanneer het luminol substraat niet snel, als substraat uitputting resulteert in verlies van signaal uitgeput is. Lysate titratie bepaalt het lineaire dynamische bereik van elke assay, die met verschillende modelsystemen, evenals verschillende antilichamen, zelfs voor hetzelfde eiwit doel verschillen kan. Antilichaam verdunningen gekozen op of nabij het verzadigen van concentraties zorgen voor veranderingen in signaal zal niet worden beïnvloed door een tekort aan vrije antilichaam, maar alleen door verschillende hoeveelheid beschikbare eiwit doel epitoop. Andere overwegingen tijdens het optimalisatieproces eventueel antilichaam-incubatietijd en stapelen/monster laadtijd. In de meeste gevallen bieden de standaardinstellingen voor het instrument de beste balans tussen resolutie en gevoeligheid. Echter in sommige gevallen kan slechte resolutie of gevoeligheid worden verbeterd door deze parameters aan te passen.
Capillaire elektroforetische gebaseerde immunoassay methoden bieden eiwit van snelle, efficiënte en reproduceerbare metingen. Terwijl deze methoden voornamelijk in onderzoek en ontwikkeling instellingen gebruikt hebben, heeft de consistentie van deze technologieën potentiële nut in regelgevings- en klinische toepassingen. Bijvoorbeeld, kan de identificatie van voor de ziekte vatbare subpopulaties toxische stoffen in het milieu of patiënten met progressie van de ziekte worden gebaseerd op proteïne biomarkers gemeten in toegankelijk matrices, zoals bloed, urine en speeksel. Als reagens en daling van de kosten van de operatie en het aantal monsters en doelen die gelijktijdig beoordeeld toeneemt kunnen, zullen we waarschijnlijk zien capillaire elektroforetische gebaseerde immunoassay methoden die worden gebruikt voor dit soort toepassingen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedank Keith Tarpley van het US EPA Office van onderzoek en ontwikkeling-Research Triangle Park (ORD-RTP) grafische en Media team voor ontwikkeling, taping, en bewerken van de instructie-video. Wij willen ook bedank Deborah Pritchett van ProteinSimple voor nuttige gesprekken met betrekking tot de optimalisatie van onze gegevens. JM Guynn werd gesteund door het Oak Ridge Instituut voor wetenschap en onderzoek/deelname onderwijsprogramma op het ons Environmental Protection Agency.
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |