Проявляется на основе капиллярно иммуноферментного анализа, используя торговую платформу для измерения белков-мишеней от подготовки общего белка. Кроме того параметры анализа времени экспозиции, концентрацию протеина и антитела разрежения оптимизированы для системы модель культуры клеток.
Новые технологии, которые используют на основе капиллярно иммуноанализа обещают быстрее и более качественных белков оценки по сравнению с традиционными иммуноанализа. Однако подобно других анализов на основе антител белка, оптимизация на основе капиллярно иммуноферментного анализа параметров, таких как концентрацию белка, разбавления антитела и время воздействия является важной предпосылкой к поколению значимой и надежной данных. Измерения должны находиться в линейный диапазон assay где изменения сигнала прямо пропорциональна изменения в lysate концентрации. Процесс выбора соответствующей lysate концентрации, разбавления антитела и воздействия раз в строке эпителиальных клеток человека бронхов, Беас 2B, показано здесь. Линейность пробирного показано в диапазоне концентраций клеточных экстракт белка p53 и α-тубулина антителами. Пример сигнала выгорания рассматривается в высоких концентрациях с длительным воздействием раз, и кривая α-тубулина разбавления антитела показано, демонстрируя насыщения. Кроме того экспериментальные результаты примера сообщается доксорубицин лечение клеток, используя оптимизированные параметры.
Капиллярного электрофореза иммуноанализа мера выражения протеина в lysates клетки с использованием систем разделения размер или заряда и обеспечивает ряд преимуществ перед традиционными иммуноанализа. Например по сравнению с западной помарки, автоматизированные процедуры, основанной на капиллярной устраняет необходимость для гелей, устройства передачи, и ручной смывки. Кроме того абсолютное количество белка требуется меньше примерно 10 раз, что делает систем на базе капиллярного идеально подходит для использования с типы клеток редких или ограниченных образца1,2. Результаты, полученные в качестве лишь 3 h, с использованием автоматизированных систем и ранее были продемонстрированы более количественный и воспроизводимые чем обычные западной помарки процедуры3,4,5. Процесс для анализов на основе размера состоит из загрузки образцов, содержащих лаурилсульфат натрия (SDS), Дитиотреитол (DTT) и дневно помечены маркерами молекулярный вес в капиллярной колонки, содержащие укладка и разделение матрицы. Напряжение тока приложенное к капиллярам отделяет протеины в образцах по размерам, и УФ света обездвиживает разлученных белков в стенке капилляров. Капилляр затем иммуно исследован с целевой объект специфического основного антитела и хрен пероксидазы (ПХ)-конъюгированных вторичное антитело. Люминол и пероксид катализировать хемилюминесцентный света поколения, которое измеряется камеру спаренных устройств (CCD) заряда и проанализированы, чтобы quantitate белка.
Несмотря на относительную простоту и скорость автоматизированной на основе капиллярного электрофореза иммуноанализа платформы оптимизация условий пробирного концентрацию белка, разбавления антитела и время воздействия имеет важное значение для получения точных, воспроизводимые результаты. В целом следует выполнить следующие процедуры, чтобы оптимизировать assay для этих систем:
1) оценить и выбрать антитела для сигнала и специфичность белка цели должно выполняться экран. Если возможно, очищенный протеин или целевой epitope может использоваться для оценки специфики; Однако все еще важно для оценки потенциальных неспецифичный сигнал в общий белок, получены из модели системы.
2) далее динамический диапазон assay необходимо определить. В идеальной ситуации сигнал удвоение (измеряется с помощью площади пика) наблюдается как образец концентрация удваивается; Однако на практике, пропорционального изменения сигнала для ввода на предсказуемой основе (например, линейные подходят) является достаточным для количественного определения белка. Кроме того эта оптимизация будет определять концентрацию белка с высоким сигнала, но все еще в пределах диапазона линейной для экспериментальной модели.
3) Определите оптимальный антитела концентрации с использованием фиксированной белка концентрации, выбранного в шаге 2 оптимизации. С увеличением концентрации антитела, сигнал увеличивается до тех пор, пока она плато на насыщенность. Концентрация антител вблизи этот уровень насыщенности необходим для точного измерения концентрации протеина.
Процесс, используемый для оптимизации концентрации белка, разбавления антитела и времени экспозиции для автоматизированной базе капиллярного размер пробирного6 показана с помощью клеточных экстрактов, изолированы от Беас 2B, SV-40 превратил человека бронхов линия эпителиальных клеток. Белка изоляции от выдержек клетки или ткани могут быть выполнены с использованием ряда опубликованных протоколов7,8,9 и не будут покрыты здесь. Результаты пробной эксперимент, используя оптимизированные условия также сообщила, в общей и фосфорилированных (сериновые 15, серина 20) p53 в культурах подвергаются доксорубицин (общий химиотерапевтического агента, который индуцирует апоптоз клеток10) на 1.2, 1.8, и 2.4 мкг/мл СМИ за 4 ч до сбора урожая. P53 пик районах нормализуются к ɑ-тубулина, который используется как элемент управления загрузки.
На протяжении десятилетий наблюдается устойчивый интерес к разработке методов капиллярного электрофореза на основе иммуноферментного анализа из-за низкой образца и реагента расходов, снижение обработки времени по сравнению с традиционными методами и высокой совместимости Автоматизируйте процедуры4,15. Существует ряд различных протоколов для разделения белков, которые использовали капилляров, включая рассев методом электрофореза, Электрокинетический, полимерные и изоэлектрической методы, которые изолировать белки с различными свойствами (соответственно, Электростатический заряд, раздел равновесия, просеивание свойства разделения матрицы и рН)16. Здесь мы описываем, основанные на антитела (или иммуноанализа) Капиллярный электрофорез метод, с использованием полимерной просеивание разделения, которая была автоматизирована и коммерчески принятой3. Преимущества этой системы включают в себя простоту использования и эксплуатации, стандартизированных и коммерчески доступных реагентов и надежный, чувствительность измерений, которые требуют меньше реагента и образцы, по сравнению с традиционными белка анализы как Западная помарка, энзим соединенный иммуноферментного анализа и другие форматы3,4,5. В предыдущих оценок этой технологии было отмечено, что размер диапазона белков, которые могут быть оценены было ограничено доступны разделения матрицы4, однако недавние предложения расширили измеряемого диапазона от 2 до 440 кДа17 . Кроме того некоторые lysate буферы известны несовместимыми с Пробирной18, поэтому отбор экспериментальных реагентов, используемых должны рассматриваться заранее.
Основным преимуществом автоматизированной процедуры с коммерчески доступных компонентов является последовательность результатов через стандартизированные методы и реагенты. Это минимизирует вероятность отказа пробирного автоматизируя важные шаги в рамках процедуры. Однако важно отметить, что некоторые виды практики, должны соблюдаться во время протокол к минимуму проблемы с капиллярного электрофореза на основе иммуноферментного анализа. Во-первых важно, что люминол S/пероксид смесь готовят свежие и сразу перед пластины загрузки. Последовательное сроков приведет к последовательным свечением после добавления окислителя, который приведет к последовательной измерений для конкретного антитела assay после анализа. Кроме того важно, что используются реагенты не истек, который в основном влияет на потенцию окислителя. Кроме того важно, что порядок загрузки образцов, антител и другие реагенты строго соблюдаться (см. Рисунок 1). Любой реагент, накапаны из места приведет к отказ пробирного и впустую run.
Помимо этих критических шагов основной проблемы, возникающие с техникой как правило могут быть преодолены путем оптимизации. Действительно эти условия являются специфическими для каждой комбинации модель системы/антитела и поэтому должны определяться эмпирически для каждого нового assay. В этой статье, мы ориентируемся на три общих процедур оптимизации: время экспозиции, lysate титрования и основное антитело разрежения. Способность генерировать измеримые результаты зависит от анализа времени экспозиции, когда субстрат luminol не истощается быстро, как субстрат истощения приводит к потере сигнала. Лизатных титрование определяет линейный динамический диапазон каждого анализа, которые могут отличаться в различных модельных системах, а также различных антител, даже для той же цели белка. Разбавления антитела выбрали на или вблизи насыщения концентрации обеспечить изменения в сигнал не будут затронуты нехватка свободного антитела, но только различия количество доступных белка целевой epitope. Другие соображения во время процесса оптимизации может включать время инкубации антитела и укладки/примеры время загрузки. В большинстве случаев настройки по умолчанию для инструмента предлагают наилучший баланс резолюции и чувствительности. Однако в некоторых случаях, плохой резолюции или чувствительность может быть улучшено путем настройки этих параметров.
Методы капиллярного электрофореза на основе иммуноферментного анализа обеспечивают быстрый, эффективный и воспроизводимые белка измерения. Хотя эти методы главным образом были использованы в исследования и разработки параметров, согласованность этих технологий имеет потенциальную полезность в нормативных и клинических приложений. Например выявление восприимчивы субпопуляций экологических токсикантов или больных с прогрессирования заболевания может основываться на белковых биомаркеров, измеряется в доступных матриц, таких как кровь, моча и слюна. Как реагент и падение расходы операции и количество образцов и целевых показателей, которые могут быть одновременно начисленных увеличивается мы увидим скорее всего капиллярного электрофореза на основе иммуноферментных методов, используемых для этих типов приложений.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Keith Tarpley нас EPA управления исследований и развития-Research Triangle Park (ORD-RTP) графических и медиа команды для развития, лентой и редактирования обучающего видео. Мы также хотели бы поблагодарить Дебора Причетт от ProteinSimple за полезные переговоры относительно оптимизации наших данных,. JM Guynn поддержал Окриджская институт науки и образования программа исследований/участие в агентство по охране окружающей среды США.
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |