En kapillär-baserad immunoassay med användande av en kommersiell plattform för att mäta målproteiner från totalprotein preparat demonstreras. Dessutom är assay parametrarna av exponeringstid, proteinkoncentration och antikropp utspädning optimerade för en modell för cellodlingssystem.
Nya teknologier som använder kapillär-baserade immunanalyser lovar snabbare och mer kvantitativ protein bedömning jämfört med traditionella immunanalyser. Liknar andra antikroppsbaserade protein assays, optimering av kapillär-baserad immunoassay parametrar, såsom proteinkoncentration, antikropp utspädning och exponeringstid är dock en viktig förutsättning till generation av meningsfulla och tillförlitlig data. Mätningar måste falla inom det linjära området analysens där förändringar i signalen är direkt proportionell till förändringar i lysate koncentration. Processen att välja lämpliga lysate koncentrationer, antikropp utspädningar och exponeringstider i raden mänsklig bronkial epitelial cell, BEAS-2B, demonstreras här. Assay linjäritet visas över en rad hela cellen extrakt protein koncentrationer med p53 och α-tubulin antikroppar. Ett exempel på signal utbrändhet ses vid de högsta koncentrationerna med långa exponeringstider, och en α-tubulin antikropp utspädning kurva visas visar mättnad. Dessutom redovisas exempel experimentella resultat för doxorubicin-behandlade celler använder optimerade parametrar.
Kapillär elektrofores immunanalyser mäter proteinuttryck i cell lysates använder storlek eller avgift separationssystem och ger flera fördelar jämfört med de traditionella immunanalyser. Till exempel jämfört med western blot, förfarandet för automatiserad kapillär-baserade eliminerar behovet av geler, överföring enheter, och manuell tvättar. Dessutom är den absoluta mängden protein som behövs cirka 10 gånger mindre, vilket gör kapillär-baserade system perfekt för användning med sällsynta celltyper eller begränsat urval1,2. Resultat erhålls i så lite som 3 h med automatiserade system och har tidigare visat sig vara mer kvantitativa och reproducerbar än konventionella western blot förfaranden3,4,5. Processen för storlek-baserade analyser består av lastning prover som innehåller sodium dodecyl sulfate (SDS), Ditiotreitol (DTT), och fluorescently märkt molekylvikt markörer i kapillär kolumner som innehåller stapling och separation matriser. Spänning att kapillärerna separerar proteiner i proverna enligt storlek och UV-ljus immobilizes separerade proteinerna i kapillär väggen. Kapillären är sedan immuno-utforskad med målet-specifik primär antikropp och pepparrot peroxidas (HRP)-konjugerad sekundär antikropp. Urin och peroxider catalyze Kemiluminiscens ljus generation som mäts av en kostnad kopplade enhet (CCD) kamera och analyseras för att kvantifiera protein.
Trots den relativa lätthet och snabbhet av en automatiserad kapillär-baserade elektroforetiska immunoassay-plattform är optimering av assay villkor såsom proteinkoncentration, antikropp utspädning och exponeringstid viktigt för att erhålla exakt och reproducerbar resultat. I allmänhet bör följande procedurer utföras för att optimera test för dessa system:
(1) en skärm bör utföras för att utvärdera och välja antikroppar för signal- och specificitet till målet för protein. Om tillgängligt, kan renat protein eller målet epitop användas att bedöma specificitet; Det är dock fortfarande viktigt att bedöma potentiella icke-specifik signal i totalt protein kommer från modellsystem.
(2) nästa, det dynamiska omfånget av analysen måste fastställas. I en ideal situation observeras signal fördubbling (mätt med hjälp av topparea) som provet koncentration fördubblas; dock i praktiken är en proportionell förändring i signal till ingång på ett förutsägbart sätt (t.ex., linjär passar) tillräckligt för protein kvantifiering. Dessutom kommer denna optimering definiera proteinkoncentration med hög signal, men fortfarande inom det linjära området för experimentell modell.
3) fastställa den optimala antikroppkoncentrationen med hjälp av fasta protein koncentrationen valdes i optimering steg 2. När antikroppkoncentrationen ökar, ökar signalen tills det platåer på mättnad. En antikroppskoncentration nära denna mättnadsnivån krävs för korrekt mätning av proteinkoncentration.
Processen används för att optimera protein koncentrationer, antikropp utspädningar och exponeringstider för en automatiserad kapillär-baserade storlek assay6 demonstreras med helcellsvaccin extrakt isolerade från BEAS-2B, en SV-40 omvandlas människa bronkial epitelial cell fodrar. Protein isolering från cell eller vävnad extrakt kan utföras med ett antal publicerade protokoll7,8,9 och behandlas inte här. Resultatet av en rättegång experiment med hjälp av de optimera villkor också rapporteras för total och fosforyleras (serin 15, serine 20) p53 i kulturer som utsätts för doxorubicin (en gemensam kemoterapeutiska medel som inducerar cell apoptos10) på 1,2, 1,8, och 2.4 µg/mL media för 4 h före skörd. P53 peak områdena är normaliserad till ɑ-tubulin, som används som en lastning kontroll.
I årtionden, det har varit ihållande intresse i utvecklingen av kapillär elektrofores-baserad immunoassay metoder på grund av låg prov och reagens utgifter, minskade bearbetning tid jämfört med traditionella metoder och hög kompatibilitet med automatisera de förfarande4,15. Det finns ett antal olika protokoll för separation av proteiner som har utnyttjat kapillärer, inklusive genom elektrofores, våra, polymer siktning och isoelektrisk metoder, som isolerar proteiner av olika egenskaper (respektive, Elektrostatisk uppladdning, delning jämvikt, siktning boenden i Separerande matris och pH)16. Här beskriver vi ett antikroppsbaserade (eller immunoassay) kapillärelektrofores metod, med en polymer som siktning separation, som har automatiserats och kommersiellt antagna3. Fördelarna med detta system är användarvänlighet och drift, standardiserade och kommersiellt tillgängliga reagenser, och tillförlitlig, känsliga mätningar som kräver mindre reagens och prover jämfört med traditionella protein analyser såsom western blot, enzymkopplad immunanalys och andra format3,4,5. Det har noterats i tidigare bedömningar av denna teknik att storleksintervallet av protein som kan bedömas har begränsats av den tillgängliga separation matrix4, men senaste erbjudanden har utökat mätbara intervallet 2 till 440 kDa17 . Dessutom måste vissa lysate buffertar är kända för att vara oförenligt med den assay18, urval av de experimentella reagens som används således i förväg.
En stor fördel med ett automatiserat förfarande med kommersiellt tillgängliga komponenter är konsekvens av resultat genom standardiserade metoder och reagenser. Detta minskar risken för assay misslyckande genom att automatisera kritiska steg i förfarandet. Det är dock viktigt att notera att vissa förfaranden måste följas under protokollet att minimera problem med den kapillär elektrofores-baserad immunoassay. Det första är det kritiskt att urin-S/peroxid blandningen är beredda färska och omedelbart innan plattan laddar. Konsekvent timing kommer att resultera i konsekvent luminiscens när oxidationsmedel är lagt, vilket resulterar i konsekvent mått för en särskild antikropp test efter test. Dessutom är det viktigt att icke-expired reagenser som används, vilket främst påverkar styrkan av oxidationsmedel. Dessutom är det viktigt att ordern lastning av prover, antikroppar och andra reagenser följas strikt (se figur 1). Någon reagens pipetteras malplacerad resulterar i assay misslyckande och en bortkastad kör.
Förutom dessa kritiska steg, kan primära problem upplevde med tekniken generellt övervinnas genom optimering. Faktiskt, dessa villkor är specifika för varje modell system/antikropp kombination och därför bör prövas empiriskt för varje ny analys. I den här artikeln fokuserar vi på tre gemensamma optimering förfaranden: exponeringstid, lysate titrering och primär antikropp utspädning. Förmågan att generera mätbara resultat beror på analys av en exponeringstid när urin substratet inte är snabbt utfiskningen, som substrat utarmning resulterar i förlust av signal. Lysate titrering avgör det linjära dynamiska omfånget av varje test, som kan variera med olika modellsystem, liksom olika antikroppar, även för samma protein mål. Antikropp utspädningar valt vid eller nära mättar koncentrationer säkerställa förändringar i signalen inte påverkas av brist på gratis antikropp, men bara av olika mängd tillgängliga protein mål epitop. Andra överväganden under optimeringsprocessen kan innehålla antikroppar inkubationstiden och stapling/prov laddningstid. Erbjuda den bästa balansen mellan upplösning och känslighet i de flesta fall standardinställningarna för instrumentet. Dock i vissa fall kan dålig upplösning eller känslighet förbättras genom att justera dessa parametrar.
Kapillär elektrofores-baserad immunoassay metoder ger snabb, effektiv och reproducerbara protein mätningar. Medan dessa metoder har främst använts i forskning och utveckling inställningar, har konsekvensen av dessa tekniker potentiella verktyg i reglerings- och kliniska tillämpningar. Identifiering av mottagliga subpopulations miljögifter eller patienter med sjukdomsprogression kan exempelvis baseras på protein biomarkörer mätt i tillgängliga matriser, såsom blod, urin och saliv. Som reagens och drift kostnader droppe och antalet prover och mål som kan vara samtidigt bedömda ökar, kommer vi sannolikt se kapillär elektrofores-baserade immunanalysmetoder för dessa typer av applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Keith Tarpley av US EPA Office i forskning och utveckling-Research Triangle Park (ORD-RTP) grafik och Media team för utveckling, tejpning och redigering av instruktions video. Vi vill också tacka Deborah Pritchett från ProteinSimple för bra konversationer om optimering av våra data. JM Guynn stöddes av Oak Ridge Institutet för vetenskap och utbildning forskning/deltagande Program på US Environmental Protection Agency.
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |