Analyse de la spécificité d'anticorps d'histone avec des microarrays de peptides

Résumé

Ce manuscrit décrit des méthodes pour l'application de la technologie des micro-aigres peptidiques au profilage spécifique des anticorps qui reconnaissent les histones et leurs modifications post-traductionnelles.

Résumé

Les modifications post-traductionnelles (PTM) sur les protéines d'histones sont largement étudiées pour leur rôle dans la régulation de la structure de la chromatine et de l'expression des gènes. La production en masse et la distribution d'anticorps spécifiques aux PTM des histones ont considérablement facilité la recherche sur ces marques. Comme les anticorps PTM des histones sont des réactifs clés pour de nombreuses applications de biochimie de la chromatine, une analyse rigoureuse de la spécificité des anticorps est nécessaire pour une interprétation précise des données et des progrès continus sur le terrain. Ce protocole décrit une pipeline intégrée pour la conception, la fabrication et l'utilisation de microarrays de peptides pour le profilage de la spécificité des anticorps histoniques. Les aspects de conception et d'analyse de cette procédure sont facilités par ArrayNinja, un logiciel logiciel ouvert et interactif que nous avons développé récemment pour rationaliser la personnalisation des formats d'impression microarray. Ce pipeline a été utilisé pour dépister un grand nombre d'antibodie d'histone PTM commercialement disponibles et largement utiliséesS, et les données générées à partir de ces expériences sont disponibles gratuitement via une base de données de spécificité d'anticorps Histone en ligne et en expansion. Au-delà des histones, la méthodologie générale décrite ici peut être largement appliquée à l'analyse des anticorps spécifiques de PTM.

Introduction

L'ADN génomique est emballé élégamment à l'intérieur du noyau de cellules eucaryotes avec des protéines d'histone pour former la chromatine. La sous-unité récurrente de la chromatine est le nucléosome, qui comprend 147 paires de bases d'ADN enroulées autour d'un noyau octamerique de protéines d'histones - H2A, H2B, H3 et H4 ¹ . La chromatine est globalement organisée en euchromatine lâchement emballée et dans les domaines de l'hétérochromatine étroitement emballés. Le degré de compactage de la chromatine régule la mesure dans laquelle les machines à protéines peuvent accéder à l'ADN sous-jacent pour mener à bien....

Protocole

1. Installation et exécution de ArrayNinja

1. Téléchargez et installez Oracle Virtual Box à partir de www.virtualbox.org.
2. Téléchargez et décompressez la machine virtuelle ArrayNinja (VM) de http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
3. Ouvrez la boîte virtuelle et ajoutez la machine virtuelle ArrayNinja en cliquant sur 'Machine', 'Ajouter' et sélectionnez arrayninja.vbox dans le dossier où ArrayNinja VM a été enregistré.
4. Commencez ArrayNinja en le sélectionnant dans la boîte virtuelle et en cliquant sur la flèche verte 'start'.
5. La boîte virtuelle ouvrira une nouvelle fenêtre et affichera un message p....

Résultats

Ce protocole a été utilisé pour concevoir et fabriquer une plate-forme de microarray peptidique pour l'analyse de la spécificité d'anticorps PTM des histones. Le tableau interroge une bibliothèque de plus de 300 caractéristiques peptidiques uniques (20 à 40 résidus de longueur) représentant une grande partie des combinaisons connues de PTM trouvés sur les protéines histone de coeur et variantes ³⁸ . Ce pipeline a été un cheval de bataille pour le dépistage.......

Discussion

La fiabilité des anticorps dans les applications de recherche biomédicale est primordiale ^{46 , 47} . Ceci est particulièrement vrai dans la biochimie de la chromatine étant donné la position des anticorps comme outils clés pour la majorité des techniques développées pour caractériser l'abondance et la distribution des PTM des histones. Le protocole présenté ici détaille un pipeline optimisé pour la conception, la fabrication et l'utilisation de microarray.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon d’impression	ArrayIt PPB
BSA	Omnipure	2390
Lames de microscope en verre revêtu de streptavidine	Greiner Bio-one	439003-25
polypropylène 384 plaque à puits	Greiner Bio-one	784201
Biotin-fluorescéine	Sigma	53608
imprimante à microréseaux de contact	Aushon	2470	Aushon 2470 Imprimante
microréseaux Imprimante à microréseaux de contact	Gene Machines	OmniGrid 100	OmniGrid Imprimante à microréseaux
PBS	Invitrogen	14190
Block Buffer ArrayIt		SBB
Stylo à cire hydrophobe	Vector Labs	H-4000	ImmEdge Barrière hydrophobe Stylo PAP
Silicon Joint	Grace Bio-labs	622511
Récipient d’hybridation	Thermo Scientific	267061	ou récipient similaire
Anticorps secondaire conjugué à colorant fluorescent	Life Technologies	A-21244	Alexa Fluor 647 (anti-lapin)
Anticorps secondaire conjugué à colorant fluorescent	Life Technologies	A-21235	Alexa Fluor 647 (anti-souris)
Cire Imprinter	ArrayIt	MSI48
Tween-20	Omnipure	9490
Microarray Scanner	Innopsys	InnoScan 1100AL	ou équivalent Scanner de microarrays
EipTitan Histone Peptide Microarray	Epicypher	112001
AbSurance Pro Histone Peptide Microarray	Millipore	16668
MODified Histone Peptide Array	Active Motif	13001
Histone Code Peptide Microarrays	JPT	His_MA_01
Wax	Royal Oak	GulfWax	pour imprimante de cire
Chambre d’hybridation de lames de microarray humidifié	VWR	97000-284
Chambre de lavage de lames de microscope à haut débit	Microscope ArrayIt	HTW
centrifugeuse à lames	VWR	93000-204
Anticorps 1	Abcam	8898
Anticorps 2	Millipore	07-473
Peptide d’histone biotinylé	EpiCypher	12-0001	Exemple de peptide. Des peptides similaires avec diverses modifications sont disponibles auprès de plusieurs sources commerciales.
ImageMagick			https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja			https://rothbartlab.vai.org/tools/

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