Lokalisering av luktantreceptormener i lokalisationsantennen genom RNA<em> I situ</em> Hybridisering
Summary
I detta dokument beskrivs ett detaljerat och högeffektivt RNA in situ- hybridiseringsprotokoll, särskilt för lågnivåer uttryckta luktantreceptor (OR) -gener liksom andra gener i insektsantenner med digoxigenin (DIG) -märkta eller biotinmärkta prober.
Abstract
Insekter har utvecklat sofistikerade olfaktiva mottagningssystem för att känna av exogena kemiska signaler. Dessa kemiska signaler transduceras av olfaktoriska receptorns neuroner (ORN) som är inrymda i hårliknande strukturer, kallad chemosensilla, av antennerna. På ORNs membran, antages det att odorantreceptorer (OR) är involverade i luktkodning. Att kunna identifiera gener som är lokaliserade till ORN-erna är således nödvändiga för att identifiera OR-gener och utgör en grundläggande grund för ytterligare funktionella in situ- studier. RNA-uttrycksnivåerna för specifika OR s i insektsantenner är mycket låga, och bevarande av insektsvävnad för histologi är utmanande. Således är det svårt att lokalisera en OR till en specifik typ av sensilla med användning av RNA in situ- hybridisering. I detta dokument införs ett detaljerat och högeffektivt RNA in situ- hybridiseringsprotokoll, särskilt för lågt uttryckta OR-gener av insekter. Dessutom en specifik OR Gen waS identifieras genom att genomföra tvåfärgade fluorescerande in situ- hybridiseringsexperiment med användning av en samuttryckande receptorgen, Orco , som en markör.
Introduction
Insektantenner, som är de viktigaste kemosensoriska organen, är täckta av många hårliknande strukturer – kallad sensilla – som är innerverade av Olfactory Receptor Neurons (ORNs). På membranet av insekts-ORNs uttrycks luktantreceptorer (OR), en typ av protein innehållande sju transmembrana domäner, med en coreceptor (ORco) för att bilda en heteromer som fungerar som en luktantgatedjonskanal 1 , 2 , 3 . Olika ORs svarar mot olika kombinationer av kemiska föreningar 4 , 5 , 6 .
Sprängor ( Locusta migratoria ) beror huvudsakligen på olfaktoriska signaler för att utlösa viktiga beteenden 7 . Locust ORs är viktiga faktorer för att förstå molekylära olfaktoriska mekanismer. Lokalisera en specifik locust OR-gen till neuron av aMorfologiskt specifik sensillumtyp av RNA In Situ Hybridization (RNA ISH) är det första steget i att utforska OR-funktionen.
RNA ISH använder en märkt komplementär RNA-sond för att mäta och lokalisera en specifik RNA-sekvens i sektion av vävnad, celler eller hela fästen in situ , vilket ger insikter i fysiologiska processer och sjukdomspatogenes. Digoxigeninmärkta (DIG-märkta) och biotinmärkta RNA-prober har använts i stor utsträckning vid RNA-hybridisering. RNA-märkning med digoxigenin-11-UTP eller biotin-16-UTP kan framställas genom in vitro- transkription med SP6- och T7-RNA-polymeraser. DIG- och biotinmärkta RNA-prober har följande fördelar: icke-radioaktiva; säker; stabil; Mycket känslig; Mycket specifika; Och lätt att producera med hjälp av PCR och in vitro transkription. DIG- och biotinmärkt RNA-prober kan vara kromogena och detekteras fluorescens. DIG-märkta RNA-prober kan detekteras med anti-digoxigeninalkaliNe-fosfatas (AP) -konjugerade antikroppar som kan visualiseras antingen med de högkänsliga kemiluminiscenta substraterna nitroblue tetrazoliumklorid / 5-brom-4-klor-3-indolylfosfattolu-dinsaltet (NBT / BCIP) med användning av ett optiskt mikroskop eller med 2 -hydroxi-3-naftosyra-2'-fenylanilidfosfat (HNPP) kopplad med 4-klor-2-metylbensen-di-etiumhemi-zinkkloridsalt (Fast Red) med användning av ett konfokalt mikroskop. Biotin-märkta RNA-prober kan detekteras med anti-biotin streptavidin hästradishperoxidas (HRP) -konjugerade antikroppar som kan visualiseras med fluoresceindyramider med användning av ett konfokalt mikroskop. Således kan fluorescerande in situ hybridisering med dubbel färg utföras för att detektera två målgener i en skiva med användning av DIG- och biotinmärkt RNA-prober.
RNA ISH med DIG- och / eller biotin-märkta prober har framgångsrikt använts för att lokalisera olfaktorrelaterade gener, såsom OR , jonotrop receptor, lukt-bindande proteinOch sensoriskt neuronmembranprotein, i insektsantenner av, men inte begränsat till, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria och ökengräshoppet Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Det finns emellertid två stora utmaningar när man utför RNA ISH för insekts-OR: (1) ELLER (utom ORco ) uttrycks i låga nivåer och endast i några celler, vilket gör signaldetektering mycket svårt och (2) bevarar insektsvävnad för Histologi, så att morfologin bevaras och bakgrundsbruset är lågt, kan vara utmanande. I detta dokument beskrivs ett detaljerat och effektivt protokoll som beskriver RNA ISH för lokalisering av OR-gener i insekterAntenner presenteras, inklusive både kromogen och tyramid Signal Amplification (TSA) detektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det är svårt att utföra RNA ISH för att lokalisera OR-gener i insektsantenner eftersom uttrycksnivåerna av OR-gener, förutom ORco , är mycket låga och att bevara histologiska skivor av insektsantenner är mycket svårt. Dessutom är TSA-detektering också mycket knepigt. För att lösa dessa problem bör följande åtgärder vidtas. Antennerna är utvalda från nyssmältande vuxna johannesbröd som har tunna och mjuka antennhalsband som håller sin morfologi på glidbanan. De frysta proven snittas i 12 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av ett bidrag från National Natural Science Foundation of China (No.31472037). Nämnandet av handelsnamn eller kommersiella produkter i denna artikel är enbart för att ge specifik information och innebär inte rekommendation.
Materials
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12%acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5%NaCl |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14mM KH2PO4 |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80mM Na2HPO4 |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1M Tris-Base |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/ml yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/ml herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
- Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
- Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
- Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
- Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
- Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
- Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412 (2013).
- Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50 (2013).
- Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
- Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
- You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
- Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two “Sensory Neuron Membrane Proteins” (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C., Wilkinson, D. G. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. , 2 (1992).
- Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
- Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
- Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).
