В режиме реального времени отслеживание разделения фрагментов ДНК с помощью смартфона
Summary
Традиционные эксперименты с электрофорезом на гелевом слое (SGE) требуют сложного аппарата и высокого потребления химических веществ. В этой работе представлен протокол, в котором описывается недорогой метод разделения фрагментов ДНК за короткий промежуток времени.
Abstract
Электрофорез на гелевом слое (SGE) является наиболее распространенным методом разделения фрагментов ДНК; Таким образом, он широко применяется в области биологии и других. Однако традиционный протокол SGE довольно утомительный, и эксперимент занимает много времени. Более того, химическое потребление в экспериментах SGE очень велико. В этой работе предлагается простой способ разделения фрагментов ДНК на основе микросхемы SGE. Чип сделан гравировальной машиной. Для длины волны возбуждения и излучения оптического сигнала используются два пластиковых листа. Сигнал флуоресценции полос ДНК собирается смартфоном. Для проверки этого метода были разделены ДНК-лестницы 50, 100 и 1000 пар оснований. Результаты показывают, что лестница ДНК размером менее 5000 пар оснований может быть разрешена в течение 12 мин и с высоким разрешением при использовании этого метода, что указывает на то, что она является идеальной заменой традиционного метода SGE.
Introduction
Электрофорез в гелевом слое (SGE) является наиболее эффективным методом разделения фрагментов ДНК 1 , 2 , 3 , 4 , 5 и, таким образом, он считается универсальным инструментом в биохимических и биологических анализах 6 , 7 , 8 . Однако многие эксперименты показывают, что SGE ограничивается следующими четырьмя проблемами: (1) отрыв занимает много часов и даже дней; (2) потребление химикатов очень велико; (3) он требует сложного устройства ( например, ячейки двумерного электрофореза, электрофореза и системы формирования изображений геля); (4) система гелеобразования может наблюдать только отделенные фрагменты ДНК, когда эксперимент закончен. Кроме того, бромид этидия (EtBr), который обычно используется в SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, является мутагенным и канцерогенным 11 , 12 . Таким образом, перчатки всегда следует носить при передаче гелей, содержащих EtBr.
Капиллярный электрофорез (CE) имеет многочисленные преимущества 13 , 14 , 15 , 16 , 17 по сравнению с SGE, такие как автоматическая работа, короткое время разделения и более низкий расход. Однако, прибор CE довольно дорог. Поэтому для преодоления этих ограничений была разработана система ( рис. 1 ) для разделения ДНК. Такая система может не только значительно снизить потребление химикатов и сэкономить время эксперимента SGE (<8 мин), но также может осуществлять отслеживание процесса разделения ДНК в агарозном геле в режиме реального времени с помощью смартфона. Следуя процедурам, описанным в этом протоколе, учащиесяLd сможет проектировать и изготовлять чип SGE, готовить агарозный гель в чипе, настраивать простую систему SGE со смартфоном и записывать процесс миграции ДНК в агарозном геле.
Protocol
Representative Results
Discussion
Электрофорез в агарозном геле широко используется для разделения ДНК, РНК и белка. В этой работе предлагается новый метод замены традиционного протокола электрофореза на геле. Результаты показывают, что ДНК-лестницы 50, 100 и 1000 пар оснований могут быть хорошо разделены на таком небольшо…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы с благодарностью признаем поддержку Национального фонда естественных наук Китая (№ 21205078) и Фонда исследований докторской программы высшего образования Китая (No.20123120110002). Эта работа была частично поддержана Национальной ключевой программой исследований и развития Китая (2016YFB1102303), Национальной программой фундаментальных исследований Китая (973Program, 2015CB352001) и Национальным научным фондом Китая (61378060).
Materials
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 |
| 50bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A |
| 100bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A |
| 1kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
- Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
- Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
- Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
- Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
- Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
- Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
- Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
- Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
- Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
- Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
- Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
- Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).
