Semiautomatica longitudinale basati su Microcomputed tomografia quantitativa analisi strutturale di un modello di relazione con l'osteoporosi fratture vertebrali del ratto nudo
Summary
L’obiettivo del presente protocollo è quello di generare un modello di frattura di compressione vertebrale correlate all’osteoporosi del ratto nudo che possa essere valutati longitudinalmente in vivo utilizzando una semiautomatica microtomografia basati su tomografia quantitativa analisi strutturale.
Abstract
Fratture di compressione vertebrali correlate all’osteoporosi (OVCFs) sono un bisogno comune e clinicamente insoddisfatto con l’aumento di prevalenza come l’invecchiamento della popolazione mondiale. Modelli animali OVCF sono essenziali per lo sviluppo preclinico di strategie di ingegneria del tessuto traslazionale. Mentre attualmente esiste un numero di modelli, questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per indurre difetti vertebrali altamente riproducibili multipli in un singolo ratto nudo. Una tomografia microtomografia semiautomatica longitudinale romanzo (µCT)-analisi strutturale quantitativa basata dei difetti vertebrali è anche dettagliato. Brevemente, i ratti erano imaged presso più tempo punti post-op. La scansione di giorno 1 è stata riorientata per una posizione standard, e un volume standard di interesse è stato definito. Scansioni successive µCT di ogni ratto sono stati registrati automaticamente alla scansione giorno 1 quindi lo stesso volume di interesse è stata poi analizzato per valutare per la formazione di nuovo osso. Questo approccio versatile può essere adattato ad una varietà di altri modelli dove analisi basate su formazione immagine longitudinale potrebbero beneficiare di preciso allineamento 3D semiautomatica. Presi insieme, questo protocollo descrive un sistema facilmente quantificabile e facilmente riproducibile per osteoporosi e ricerca. Il protocollo suggerito dura 4 mesi per indurre osteoporosi in ratti ovariectomizzati nudi e tra 2,7 e 4 h di generare, immagine e analizzare due difetti vertebrali, a seconda della dimensione del tessuto e attrezzature.
Introduction
Più di 200 milioni di persone nel mondo soffrono di osteoporosi1. Il sottostante patologica diminuzione nella densità minerale ossea (BMD) e microarchitettura ossea alterata aumentare la fragilità ossea e, di conseguenza, il rischio relativo di frattura2. L’osteoporosi è così prevalente e dannosa per la salute che l’OMS ha definito un problema importante di sanità pubblica. Inoltre, come la popolazione mondiale è previsto per età, l’osteoporosi è destinato a diventare ancora più comune.
Le fratture vertebrali osteoporotiche da compressione sono le più comuni fratture di fragilità, stimate a più di 750.000 all’anno negli Stati Uniti. Essi sono associati con la morbosità significativa e tanto come una mortalità più alta nove volte tasso3. Negli studi clinici, attualmente disponibili interventi chirurgici, come la vertebroplastica e Cifoplastica, sono stati trovati per non essere di più efficace di un finto trattamento4,5, lasciando solo gestione del dolore disponibile per questi pazienti. Poiché i trattamenti OVCF correnti sono limitati, è imperativo per sviluppare un modello animale che può replicare il disordine6,7,8. Tali modelli animali potrebbero facilitare sia l’indagine sui metodi di trattamento attuali e lo sviluppo di nuove terapie che si tradurranno in pratica clinica. L’osteoporosi è stata indotta e sostenuta in modelli animali attraverso la somministrazione di una dieta basso-calcio (LCD) in combinazione con l’ovariectomia1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. per modellare ulteriormente la perdita ossea associata OVCFs, difetti ossei vertebrali sono stati stabiliti in ratti immunocompetent osteoporotiche 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. In questo lavoro, viene presentato un modello di difetto vertebrale dei ratti immunocompromessi con osteoporosi modellato. Questo nuovo modello consente di valutare le terapie basate sulle cellule che coinvolge le cellule staminali derivate da varie fonti e specie per la riparazione delle fratture difficili, ad esempio OVCFs.
Formazione immagine dell’osso è una parte cruciale della valutazione delle fratture e malattie delle ossa. Metodi di imaging avanzati sono stati sviluppati per la valutazione accurata dei cambiamenti strutturali dell’osso e rigenerazione strategie25. Fra loro, formazione immagine di µCT è emerso come un metodo non invasivo, facile da usare e poco costoso che fornisce immagini 3D ad alta risoluzione. Formazione immagine µCT presenta parecchi vantaggi sopra altre modalità nella valutazione di pazienti con osteoporosi, in quanto offre 3D ad alta risoluzione dell’osso microarchitettura26 che possono poi essere analizzati quantitativamente. Quest’ultimo può quindi essere utilizzato per confrontare gli effetti terapeutici dei trattamenti proposti. In vivo imaging µCT infatti un gold standard per la rigenerazione di difetti vertebrali monitoraggio1,16,27. Tuttavia, alcune pubblicazioni28,29,30,31 sono impiegati strumenti di registrazione automatizzati per ridurre al minimo l’utente-dipendenza, bias di interpolazione ed errore di precisione di µCT analisi basata su formazione immagine. Recentemente, siamo stati i primi ad utilizzare una procedura di registrazione per migliorare l’analisi della rigenerazione ossea in un osso standardizzato sub, come spiegato in questo protocollo32 .
Il metodo qui descritto può essere utilizzato per studiare l’effetto delle terapie di cellula romanzo per OVCFs, unhindered dall’host di risposte a cellula T che potrebbero rifiutare le cellule allogeniche o xenogeniche. L’osteoporosi è indotto in ratti giovani attraverso l’ovariectomia (OVX) e 4 mesi di un LCD. La giovane età dei ratti OVX, combinato con il display LCD, ci ha permesso di raggiungere un basso picco di massa ossea, che imita l’osteoporosi postmenopausale conducendo alla perdita irreversibile dell’osso. Ciò può essere spiegato in parte dal fatto che, durante il display LCD e a circa 3 mesi di età, la transizione di ratti dall’osso modellazione al rimodellamento fase presso le vertebre lombari33, aumentando così la probabilità di mantenere l’osteoporosi nel tempo. Utilizzando animali giovani rende questo modello più conveniente, che costano meno. Tuttavia, è limitata intrinsecamente non tenendo conto i cambiamenti biologici all’animale di invecchiamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’osteoporosi è la causa più prevalente delle fratture vertebrali da compressione causata da un aumento del carico sulla colonna vertebrale e che provocano il collasso del corpo vertebrale. Tuttavia, è praticamente impossibile generare una ferita in un roditore che autenticamente replica un simile crollo vertebrale. Invece, i ricercatori creano un vuoto cilindrico al centro del corpo vertebrale per imitare OVCFs16,17,18,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione al California Institute per la medicina rigenerativa (CIRM) (TR2-01780).
Materials
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate2%scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine0.3mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, 45°Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears – Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 ml | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment | |||
References
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