半自動縦マイクロ トモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折
1Skeletal Biotech Laboratory,Hebrew University-Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery,Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute,Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute,Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Orthopedics,Cedars-Sinai Medical Center
Summary
このプロトコルの目的は、長手方向評価できる生体内で半自動マイクロ断層レントゲン写真撮影に基づいて定量的構造解析を用いた裸ラット骨粗鬆症による脊椎圧迫骨折モデルを生成することです。
Abstract
骨粗鬆症による脊椎圧迫骨折 (OVCFs) は、世界の人口年齢として有病率の増加とともに共通と臨床的に満たされていない必要です。動物の OVCF モデルは、並進ティッシュ エンジニア リング戦略の前臨床開発に不可欠です。モデルの数が現在存在している間このプロトコルは単一の裸ラットで複数の再現性の高い椎体欠陥を誘導するための最適化手法について説明します。新規縦半自動マイクロ断層レントゲン写真撮影 (µCT)-椎体欠陥に基づいて定量的構造解析はまた、詳細な。簡単に言えば、手術後に複数の時間ポイントでラットをイメージしました。1 日目のスキャンが標準位置に向きを変えると関心の標準的な量を定義しました。各ラットのそれに続く µCT スキャンは、関心の同じボリュームを新しい骨の形成の評価を分析したので 1 日目スキャンに自動的に登録されました。この柔軟なアプローチは、様々 な他のモデルの正確な 3 D 半自動線形から縦断的イメージングによる解析を恩恵に合わせることができます。一緒に取られて、このプロトコルでは、骨粗しょう症や骨の研究のための容易に定量化できると簡単に再現できるシステムをについて説明します。提案されたプロトコルは、2.7 と 4 h 生成、イメージ、および組織のサイズおよび装置によって 2 つの椎体欠陥を分析して裸の卵巣摘出ラットにおける骨粗鬆症を誘発する 4 ヶ月かかります。
Introduction
世界中で以上 2 億人は骨粗鬆症1に苦しんでいます。骨密度 (BMD) の低下基礎となる病理学的、変更された骨微細構造骨の脆弱性と、その結果、破壊2の相対リスクを増やします。骨粗鬆症は横行し、誰がそれを主要な公衆衛生問題に定義の健康に有害です。さらに、世界の人口を年齢どおり、骨粗しょう症がより一般的になると予想されます。
骨粗鬆症性椎体圧迫骨折が最も一般的な脆弱性骨折は、米国で年間 750,000 以上と推定です。9 倍より高い死亡率率は3として重要な罹患率と同じくらいに関連付けられます。臨床試験で現在亀背形成術、椎体形成術などの利用可能な外科的介入がないのより効果的なよりも偽治療4、5、これらの患者に利用できるだけ痛みの管理を離れることが判明。現在の OVCF 治療法が限られているので障害6,7、8をレプリケートすることができます動物のモデルを開発することが不可欠です。このような動物のモデルは、現在の治療法の研究と臨床に変換する新規治療法の開発を促進できます。骨粗鬆症を誘発されており卵巣1,9,10、11,と組み合わせて低カルシウム飼料 (LCD) の投与によるモデル動物で持続的な12,13,14,15. さらにモデルで OVCFs に関連付けられている骨は、椎体骨欠損は骨粗鬆症免疫ラット16,17,18,19、設立されました。 20,21,22,23,24。この作品は、モデル化された骨粗しょう症免疫不全ラットの椎骨の欠陥モデルが表示されます。この小説のモデルは、様々 なソースや OVCFs などの挑戦的な骨折の修復の種由来幹細胞を含む細胞ベースの治療を評価するために使用できます。
骨イメージングは、骨折や骨の病気の評価の重要な部分です。高度なイメージング法は、骨の構造変化と再生戦略25の正確な評価のため開発されました。その中でも、µCT イメージングは、高解像度の 3 D 画像を提供する非侵襲的な使いやすい、安価な方法として浮上しています。µCT イメージングには、高解像度 3 D 骨定量的分析できますマイクロアーキテクチャー26骨粗鬆症患者の評価に他の治療法にいくつかの利点があります。後者は、提案された治療法の治療効果を比較するし使用できます。確かに、µCT 画像生体内では、脊椎骨欠損再生1,16,27を監視のためのゴールド スタンダードです。ただし、いくつかの出版物28,29,30,31ユーザー依存関係、補間バイアス、および µCT の精度誤差を最小限に抑える自動登録ツールを採用しています。イメージングによる解析。最近では、登録手順を使用してこのプロトコル32で説明したように void、標準化された骨における骨再生の分析を向上させる最初ができました。
ここで説明する方法は OVCFs のための新しい細胞療法の効果を研究するため、異種または同種細胞を拒絶するかもしれない T 細胞応答のホストによって妨げられていません。骨粗しょう症は、幼若ラット卵巣摘出 (OVX) と LCD の 4 ヶ月間で誘導されます。LCD と組み合わせて OVX のラットの若い年齢の許可、不可逆的な骨の損失へ導くことによって閉経後骨粗鬆症を模倣した低ピーク骨量に到達します。これは部分的という事実によって、モデリングを改造する骨からラット転移の年齢の約 3 ヵ月、液晶中に腰椎33、上、骨粗しょう症を維持する可能性が高まる相説明できます。時間。若い動物を使用してこのモデルを作るよりコスト効率の高い、低コストに。それにもかかわらず、それは本質的にいない高齢動物の生物学的変化の会計によって制限されます。
Protocol
機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ヒマラヤスギ シナイの医療センター (プロトコル # 3609) によって承認されたプロトコルの下ですべての動物実験を行った。すべてのイメージングおよび外科手術の麻酔を投与されました。すべての動物は、承認された IACUC プロトコルに従って収容された。 注: このプロトコルの実験的なデザインは、 図 1 に?…
Representative Results
このプロトコルを使用して、1 つはイメージでき、n の再生を定量化する異なる時間ポイント間 8 モデル骨粗鬆症性椎体欠陥を =。登録手続きによって得られる解剖学的な一致はすべての時点で同じ VOI の分析のためできます。元の不具合の余白を認識しないときにも、非常に正確な縦 3 D 組織計量解析でこの結果します。骨再生 (図 7) の縦断的評…
Discussion
骨粗しょう症は、脊椎の椎体の崩壊、その結果負荷の増大による脊椎圧迫骨折の最も一般的な原因です。ただし、本物と同様の脊椎骨崩壊を複製する齧歯動物で傷害を生成する実質的に不可能です。研究者が OVCFs16,17,18,19,20,21,<sup class="x…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究は、再生医学 (CIRM) (TR2-01780) カリフォルニア研究所からの助成金によって支えられました。
Materials
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate2%scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine0.3mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, 45°Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears – Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 ml | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment | |||
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Citer Cet Article
Shapiro, G., Bez, M., Tawackoli, W., Gazit, Z., Gazit, D., Pelled, G. Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model. J. Vis. Exp. (127), e55928, doi:10.3791/55928 (2017).