Assay voor fosforylatie en microtubulus bindende samen met lokalisatie van Tau-eiwit in Colorectal kankercellen
Summary
Dit manuscript wordt beschreven standaardprotocollen voor het meten van tau hyperphosphorylation, tau binding aan de microtubuli, en lokalisatie van intracellulaire tau drug behandelingen na te meten. Deze protocollen kunnen herhaaldelijk worden gebruikt voor het screenen van drugs of andere verbindingen die gericht zijn op tau hyperphosphorylation of microtubulus bindend.
Abstract
De microtubulus-geassocieerde eiwit tau is een neuronale eiwit dat meestal in axonen lokaliseert. Over het algemeen is tau essentieel voor normale neuronale functioneren omdat het is betrokken bij microtubulus vergadering en stabilisatie. Naast neuronen, wordt tau uitgedrukt in de menselijke borst, prostaat, maag, colorectale, en alvleesklier kanker waar het toont bijna vergelijkbare structuur en soortgelijke functies uitoefent als de neuronale tau. Het bedrag van tau en haar fosforylatie kunt wijzigen van haar functie als stabilisator van microtubuli, en leiden tot de ontwikkeling van de gepaarde spiraalvormige gloeidraden in verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer. Vaststelling van de staat van de fosforylatie van tau en de microtubuli-bindende eigenschappen ervan is belangrijk. Daarnaast is onderzoekt de intracellulaire lokalisatie van tau belangrijk in verschillende ziekten. Dit manuscript details standaardprotocollen voor het meten van tau fosforylatie en tau binding aan microtubuli in colorectal kankercellen met of zonder curcumine en LiCl behandeling. Deze behandelingen kunnen worden gebruikt om kanker celproliferatie en ontwikkeling te stoppen. Intracellulaire lokalisatie van tau wordt onderzocht met behulp van immunohistochemistry en confocale microscopie tijdens het gebruik van lage hoeveelheid antilichamen. Deze testen kunnen herhaaldelijk worden gebruikt voor het screenen van verbindingen die tau hyperphosphorylation of microtubulus bindende beïnvloeden. Roman therapeutics gebruikt voor verschillende tauopathies of verwante anticancer agents kunnen mogelijk worden gekarakteriseerd met behulp van deze protocollen.
Introduction
Tau werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een warmte-stable microtubulus-geassocieerde proteïne, dat mede gezuiverde met tubuline1 was. Tau wordt uitsluitend uitgedrukt in hogere eukaryoten2,–3,4. De belangrijkste functie van tau is controle microtubulus vergadering1,5,6. Het draagt ook bij aan de polymerisatie van microtubuli7axonale vervoer8, veranderingen in axonale diameter9, vorming van neuroma polariteit en neurodegeneratie10. Tau fungeert ook als een eiwit steiger om te controleren enkele signaalroutes. Rat hersenen studies suggereren dat tau is neuron-specifieke en dat het voornamelijk in axonen11 lokaliseert. Omdat tau essentieel voor microtubuli polymerisatie en neuronale ontwikkeling is, was tau hypothetische om te spelen een belangrijke rol in axonale ontwikkeling in het centrale zenuwstelsel; deze hypothese werd later gecontroleerd door in vitro en in vivo experimenten. Naast neuronen, wordt tau uitgedrukt in verschillende non-neuronale cellen, met inbegrip van lever, nieren en spieren cellen12,13. Tau komt ook tot uiting in de menselijke borst, prostaat, colorectale, maag, en alvleesklier kanker cel lijnen en weefsels14,15,16,17,18, 19. tau wordt ook gevonden in opname-lichaam myositis als gedraaide tubulofilaments in integratie organen20.
Tau kan verschillende posttranslationele modificaties uitvoeren. Van alle posttranslationele modificaties is fosforylatie de meest voorkomende. Verhoogde tau fosforylatie vermindert zijn affiniteit voor de microtubuli, ten slotte destabiliserende het cytoskelet. Vijfentachtig fosforylatie sites zijn beschreven in tau-eiwit geïsoleerd uit menselijke Alzheimerpatiënten hersenen weefsels. Deze sites vormen 53% slechts 6% tyrosine residuen21,22,23, serine en threonine van 41%. Tau fosforylatie van invloed is op de lokalisatie, functie, bindende, oplosbaarheid en haar gevoeligheid voor andere posttranslationele modificaties. Meer dan de normale omvang ook tau fosforylatie (of volledig verzadigd met fosfaat groepen) staat bekend als hyperphosphorylation die structurele en functionele kenmerken van de ziekte van Alzheimer24repliceert. Tau onderhoudt goede werking van de axonale microtubuli en zorgt voor een normale neuronale werking onder fysiologische omstandigheden. Hyperphosphorylated tau mislukt echter om een overzichtelijk microtubulus-binding, waardoor neuronale verlies vanwege microtubulus demontage. Normale niveaus van tau fosforylatie zijn vereist voor juiste tau werking, maar tau mislukt om normaal te functioneren als haar karakteristieke fosforylatie niveau wordt gewijzigd en als het hyperphosphorylated25. In de ziekte van Alzheimer en sommige andere leeftijdsgebonden neurodegeneratieve aandoeningen, tau wordt hyperphosphorylated en vormt de gepaarde spiraalvormige filamenten en neurofibrillary klitten26,27. Dus, de methoden voor de bepaling van tau fosforylatie en microtubulus bindend zijn belangrijk.
Colorectaal carcinoom, een vergrijzing-geassocieerde kanker, is dat de derde meest voorkomende diagnose kanker en de derde prominente dood veroorzaken kanker voor mannen én vrouwen28. Colorectal kanker is één van de belangrijkste dood-veroorzaakt kanker in de westerse wereld29. Omdat zowel colorectale kanker en de ziekte van Alzheimer geassocieerd met vergrijzing worden en beide voornamelijk in de ontwikkelde landen waar de mensen genieten van soortgelijke voedingsgewoonten gebeuren, kunnen de twee ziekten een of andere manier worden gecorreleerd. Daarnaast reageren tau-positieve en tau-negatieve kankercellen anders op chemotherapeutische agenten, bijvoorbeeld, paclitaxel16.
Curcumine is een van de belangrijkste derivaten van Curcuma longa, de Indische specerij kurkuma30. Eeuwenlang hebben de Zuid-Aziatische populaties kurkuma in hun dieet op een dagelijkse basis verbruikt. Curcumine is gebruikt voor de behandeling van verschillende ziekten, met inbegrip van colorectal kanker, de ziekte van Alzheimer, diabetes, cystic fibrosis, inflammatoire darmziekte, artritis, hyperlipidemie, atherosclerose en ischemische hartziekte31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lithium kan ook colorectal kankercellen doden of te voorkomen dat hun proliferatie39. Lithium kan ook worden gebruikt voor de behandeling van de ziekte van Alzheimer40 zoals het tau aggregatie vermindert en de hyperphosphorylation voorkomt zoals waargenomen in een transgene muis model41,42,43, 44.
Dit manuscript wil: 1) meet de totale tau en de phospho-tau expressie niveaus in de behandelde cellen; 2) beschrijven een fosfatase assay voor het meten van totale tau fosforylatie; 3) onderzoeken microtubuli-bindende voor tau; en 4) lokaliseren tau door confocale microscopie in colorectal kanker cellijnen behandeld met curcumine of LiCl. Resultaten blijkt dat de behandeling van de cel met curcumine, die een zogenaamd goede chemotherapeutische agent voor darmkanker is, en behandeling met LiCl uitdrukking van beide totale tau kan verminderen en phosphorylated tau in colorectal kanker cellijnen. Deze behandelingen kunnen ook leiden tot nucleaire translocatie van tau. Echter onverwacht, mislukt curcumine om de binding van tau tot microtubuli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit manuscript opgericht verschillende procedurele voorwaarden voor het opsporen van totale tau en phosphorylated tau in colorectal kankercellen behandeld met curcumine en LiCl. Om te beoordelen van de algehele status van de fosforylatie van tau in EiwitSteekproeven, werd een fosfatase assay beschreven. Deze test kan potentieel te onderzoeken van de status van de fosforylatie van een eiwit worden gebruikt.
Deze test is gebaseerd op het beginsel dat phosphorylated eiwit beweegt trager dan de ni…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd uitgevoerd als onderdeel van het project getiteld ‘Ontwikkeling en industrialisatie van hoge waarde cosmetische grondstoffen uit mariene microalgen’, gefinancierd door het ministerie van oceanen en visserij, Korea, en werd gesteund door een intramurale grant (2Z04930) van KIST Gangneung Instituut van natuurlijke producten.
Materials
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Store at -20 °C |
| penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA solution | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm dish | Corning | 430161 | |
| 6 well plate | Corning | Coster 3516 | |
| Anti-Tau 13 antibody | abcam | ab19030 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microlitre Centrifuges | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microtubules (MT) | Cytoskeleton | MT001 | Store at 4 °C (desiccated) |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Store at -20 °C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Store at 4 °C |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| α-tubulin (11H10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2125 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2118 | |
| Anti-Tau (phospho S396) antibody | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Store at room temperature |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | Store at -20 °C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Store at room temperature |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5870 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5871 | Store at 4 °C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Tau-352 human | Sigma | T 9950 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X – 100 | Store at around 25 °C |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11005 | Store at 4 °C in the dark |
| Confocal Microscopy | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Store at 4 °C |
References
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
- Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
- Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer’s disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
- Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
- Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
- Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
- Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
- Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
- Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
- Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
- Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
- Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
- Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
- Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
- Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
- Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
- Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
- Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
- Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
- Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
- Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
- Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer’s disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
- Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
- Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526 (2012).
- Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
- Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
- Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
- Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
- Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
- Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
- Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
- Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
- Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
- Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
- Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
- Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer’s disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
- Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864 (2014).
- Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer’s disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
- Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
- Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
- Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
- Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
- Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
- Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
- Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
- Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer’s Disease. Biomolecules. 6, 9 (2016).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).
