Summary

Peptídeos e proteínas quantificação usando Automated imuno-MALDI (iMALDI)

Published: August 18, 2017
doi:

Summary

Um protocolo para a quantificação de proteínas em fluidos biológicos complexos usando tecnologia automatizada imuno-MALDI (iMALDI) é apresentado.

Abstract

Espectrometria de massa (MS) é uma das tecnologias mais utilizadas para quantificar proteínas em amostras complexas, com especificidade de excelente ensaio em resultado da detecção direta de relação massa-de-carga de cada molécula do alvo. No entanto, proteômica baseada em MS, como a maioria das outras técnicas analíticas, tem um viés para medição alta abundância analitos, então é um desafio para atingir limites de deteção de baixo ng/mL ou pg/mL em amostras complexas e isto é o intervalo de concentração para muitos doença-relevantes proteínas em biofluids tais como plasma humano. Para auxiliar na detecção de baixa abundância analitos, imuno-enriquecimento foi integrado no ensaio para concentrar-se e purificar o analito antes da medição do MS, melhorando significativamente a sensibilidade do ensaio. Neste trabalho, a imuno – Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização (iMALDI) tecnologia é apresentada para a quantificação de proteínas e peptídeos em biofluids, com base em imuno-enriquecimento em grânulos, seguida por MALDI-MS medição sem prévia eluição. Os anticorpos antipeptídeos são acrescidos em grânulos magnéticos e incubados com amostras. Após a lavagem, os grânulos são transferidos diretamente em uma placa de destino MALDI, e os sinais são medidos por um MALDI-tempo de instrumento de voo (MALDI-TOF) após a solução de matriz foi aplicada aos talões. O procedimento de preparação de amostra é simplificado em comparação com outros ensaios imuno-MS, e a medição de MALDI é rápida. A preparação de toda a amostra é automatizada com um manuseio sistema, com reprodutibilidade do ensaio melhorada e uma taxa de transferência de líquidos. Neste artigo, o ensaio de iMALDI é usado para determinar a angiotensina peptídeo eu (Ang eu) concentração no plasma, que é usado clinicamente como leitura da atividade de renina do plasma para o rastreio de aldosteronismo primário (PA).

Introduction

Espectrometria de massa tornou-se uma ferramenta indispensável em proteômica quantitativa. Espectrometria de massa pode determinar as massas de alvo proteínas ou peptídeos, portanto, os sinais obtidos do analito podem ser altamente específicos em comparação com os imunoensaios. Dois métodos de ionização, electrospray e MALDI, são mais comumente utilizados para a detecção de proteínas e peptídeos1,2,3,4. Um grande desafio na quantificação da proteína baseada em MS situa-se na detecção de proteínas de baixo-abundância em amostras complexas, em concentrações ng/mL ou pg/mL, na presença de proteínas de alta-abundância, e muitos biomarcadores de candidato proteína encontradas no plasma humano são dentro desta escala5. Esse problema é causado pela maior parte pelo inerentemente ampla faixa dinâmica e complexidade do proteoma humano6.

Para superar esses desafios de deteção, foram desenvolvidos métodos imuno-MS para enriquecer o alvo proteínas ou peptídeos partir das soluções de amostra em uma superfície sólida, seguido por eluição dos analitos e MS medição7,8 , 9 , 10. através de imuno-enriquecimento, os analitos são purificados de amostras complexas e, por conseguinte, os efeitos do íon-supressão de outras moléculas são minimizados. Entre vários suportes sólidos, grânulos magnéticos são atualmente mais amplamente utilizados como eles têm as vantagens da capacidade de ligação do anticorpo alta e facilidade de manuseio. Esferas magnéticas com functionalizations diferentes e tamanhos foram desenvolvidas e comercializadas para experimentos de imunoprecipitação. Até à data, imuno-enriquecimento em grânulos tem sido interfaceado com ionização electrospray (ESI) e MALDI-MS para medição de proteínas e peptídeos. Em padrões de isótopo estável e captura pela tecnologia de anticorpos antipeptídeo (SISCAPA), proteínas nas amostras são digeridas, seguido de incubação com grânulos de anticorpo-revestido para imuno-enriquecimento. No SISCAPA “clássica”, os peptídeos proteotypic capturados são eluídos dos grânulos e medidos pelo líquido cromatografia-ESI-MS (LC-MS), ou por infusão direta ESI-múltiplas reação monitoramento-MS (ESI-MRM-MS)11,12. Imuno-enriquecimento melhorou a sensibilidade do ensaio MRM, por 3-4 ordens de magnitude, atingindo os de gama baixa ng/mL13.

Em comparação com electrospray-MS, MALDI-MS é mais rápido e não envolve a limpeza e a re-equilibração de colunas LC então não há problemas reportes e contaminação, tornando-o mais adequado para estudos de alta produtividade14. Imuno-MALDI tecnologia foi desenvolvida em nosso laboratório para combinar imuno-enriquecimento com MALDI-MS para quantificação de sensível e específica de peptídeos e proteínas (com base na quantificação de peptídeos proteotypic)15,16 ,17. Depois imuno-enriquecimento, os grânulos são depositados sobre uma placa MALDI-alvo, a solução de matriz é adicionado à grânulos e o prato está pronto para análise por um MALDI-TOF-MS após a secagem. Eluição dos peptides da missanga não é executada como uma etapa separada, mas ligados a afinidade analitos são eluídos por solução de matriz a MALDI quando ele é adicionado aos pontos do grânulo, desse modo simplificando a preparação da amostra e minimizando a perda de amostra. A tecnologia de iMALDI tem sido aplicada em uma variedade de aplicações de18,19e recentemente foi automatizada e utilizada para a medição da angiotensina eu (Ang eu) para a determinação de plasma renina atividade (PRA)20. Este protocolo irá demonstrar o procedimento utilizado para realizar um ensaio iMALDI automatizado. O ensaio PRA a tomar como exemplo, inter dias CVs de menos de 10% foram obtidos por meio da automação, com a capacidade de medir 744 amostras por dia20.

O ensaio PRA iMALDI demonstrado neste manuscrito não requer digestão de proteínas, como a molécula alvo (Ang eu) é um peptídeo com um peso molecular de 1295.7 Da. Em outros ensaios, onde a digestão de proteínas é necessário e um peptídeo é usado como o substituto para a proteína intacta, o peptídeo selecionado para iMALDI deve ser exclusivo e específico para a proteína do alvo, com uma massa mais de 800 Da então que ele pode ser distinguido facilmente o c hemical ruído a partir da solução de matriz MALDI. Anticorpos antipeptídeos são necessários para o imuno-enriquecimento dos peptides. O protocolo para um ensaio de iMALDI medição PRA consiste em quatro etapas: 1) geração de Ang I em plasma humano; 2) imuno-enriquecimento de Ang I usando grânulos anticorpo-revestido; 3) transferência de contas para uma placa-alvo MALDI e adicionando solução de matriz; e 4) aquisição de sinal por uma análise de dados e MALDI-TOF-MS20.

Protocol

as quantidades dos reagentes descritos abaixo são baseadas na medição de 20 amostras de plasma do paciente. O protocolo apresentado abaixo segue as orientações do Universidade de Victoria ' Comissão de ética de pesquisa humana s. 1. geração de Ang I em Plasma humano descongelar amostras de plasma (≥ 200 µ l) em uma sala de temperatura água banho por 5 min e em seguida, colocar as amostras no gelo até completamente derretido. Transferência de 200 µ …

Representative Results

Um procedimento iMALDI automatizado para medição de Ang é mostrado na Figura 1. Peptídeos de alvo (endógenos ou peptídeos de proteínas digeridas) são enriquecidos em grânulos magnéticos antipeptídeos, e em seguida as contas são transferidas para uma placa-alvo para a medição de MALDI. Todo o processo é simplificado em comparação com outras tecnologias de imuno-MS que exigem etapas de eluição de peptídeo adicionais. Automação do ensaio iM…

Discussion

Comparado a quantificação de proteína convencional baseada em MS, iMALDI utiliza anticorpos para enriquecer os analitos e purificá-los de amostras complexas, portanto, tornando possível quantificar proteínas ou peptídeos em baixas concentrações. Um passo crítico no protocolo iMALDI é o imuno-enriquecimento dos peptides alvo. Para este efeito, devem ser selecionados anticorpos com alta especificidade e afinidade. Em SISCAPA, relatou-se que seriam necessários para atingir alta sensibilidade em baixa ng/mL<sup c…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o apoio financeiro de Canadá do genoma e genoma da Colúmbia Britânica para operações (204PRO) e desenvolvimento de tecnologia (214PRO) através de rede de inovações o genoma (gim). Agradecemos a plataforma de descoberta de drogas do Instituto de pesquisa do centro de saúde de Universidade McGill para a utilização do instrumento MALDI-TOF para as filmagens. H.L. é grato pelo apoio de uma bolsa de pós-doutorado do nacional de ciência e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC). C.H.B é grato pelo apoio de fundo de dotação a Leading Edge (Lopes). C.H.B. é grato pelo apoio da cadeira McGill Segal em Oncologia Molecular da McGill University (Montreal, Quebec, Canadá). M.X.C. e C.H.B. estão gratos pelo apoio de Warren Y. Soper Charitable Trust e o Alvin Segal Family Foundation para o Hospital Geral judaico (Montreal, Quebec, Canadá).

Materials

Healthy control human plasma Bioreclamation HMPLEDTA2
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 09830
Ammonium citrate dibasic Sigma Aldrich 09833
CHAPS (>=98%) Sigma Aldrich C9426
Albumin from chicken egg white (>98%) Sigma Aldrich A5503
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich EDS
Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma Aldrich 70990
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma Aldrich 78830
Trifluoroacetic acid Thermo Fisher Scientific 85172 LC-MS grade
acetonitrile Fluka 34967 LC-MS grade
water Fluka 39253 LC-MS grade
acetic acid Fluka 320099 LC-MS grade
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Roche Diagnostics 3118169001
Dynabeads Protein G magnetic beads Thermo Fisher Scientific 10003D 2.8 μm, 30 mg/mL
anti-Ang I goat polyclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-7419
Nat and SIS Ang I synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre
Automated liquid handling system Agilent 16050-102 Agilent Bravo robotic workstation
Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Invitrogen DynaMag-2 magnet
Tube rotator Theromo Scientific 400110Q Labquake Tube Rotator
Magnet Thermo Fisher Scientific 12027 DynaMag-96 side skirted magnet
Magnet VP Scientific 771RM-1 used to pull the beads to the bottom of the well
MALDI-TOF Bruker Bruker Microflex LRF instrument

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Citer Cet Article
Li, H., Popp, R., Frohlich, B., Chen, M. X., Borchers, C. H. Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI). J. Vis. Exp. (126), e55933, doi:10.3791/55933 (2017).

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