Peptid og Protein kvantifisering bruke automatisert Immuno-MALDI (iMALDI)
Summary
En protokoll for protein kvantifiseringen i komplekse biologiske væsker ved hjelp av automatiserte immuno-MALDI (iMALDI) teknologi er presentert.
Abstract
Massespektrometri (MS) er en av de mest brukte teknologiene for kvantifisere proteiner i komplekse prøver, med utmerket analysen spesifisitet som følge av direkte deteksjon av masse-til-lade forholdet mellom hvert mål molekylet. Men baserte Proteomikk, som de fleste andre analytiske teknikker, har en bias mot måle høy-overflod analytter, så det er utfordrende for å oppnå oppdagelsen begrenser lav ng/ml eller pg/mL i komplekse eksempler, og dette er området konsentrasjon for mange sykdom relevante proteiner i biofluids som humant plasma. For å bistå i deteksjon av lav-overflod analytter, har immuno-berikelse blitt integrert i analysen å konsentrere seg og rense analytt før MS måling, betydelig bedre analysen følsomhet. I dette arbeidet, er negative Matrix-Assisted Laser desorpsjon/Ionization (iMALDI) teknologien presentert for kvantifisering av proteiner og peptider i biofluids, basert på immuno-berikelse på perler, etterfulgt av MALDI-MS måling uten forutgående elueringsrør. Anti-peptid antistoffer er functionalized på magnetiske perler, og inkubert med eksempler. Etter vasking, perler overføres direkte til en MALDI mål plate, og signalene er målt ved en MALDI-tid på fly (MALDI-TOF) instrument etter matrix løsningen brukes på perlene. Eksempel forberedelse prosedyren er forenklet sammenlignet med andre immuno-MS analyser, og MALDI målingen er rask. Hele utvalget forberedelsene er automatisert med en væske håndteringssystem, med forbedret analysen reproduserbarhet og høyere gjennomstrømming. I denne artikkelen, iMALDI analysen er brukt for å bestemme peptid angiotensin jeg (Ang jeg) konsentrasjon i plasma, som brukes klinisk som avlesning plasma renin aktivitet for screening av primære aldosteronism (PA).
Introduction
Massespektrometri har blitt et uunnværlig verktøy i kvantitative Proteomikk. Massespektrometri kan bestemme massene av målet proteiner eller peptider, innhentet analytt signalene kan derfor være svært spesifikke forhold til immunanalyser. To ionisering metoder, electrospray og MALDI, brukes vanligvis for å oppdage proteiner og peptider1,2,3,4. En stor utfordring i baserte protein kvantifisering ligger i deteksjon av lav-overflod proteiner i komplekse eksempler på ng/mL eller pg/mL konsentrasjonen i nærvær av høy-overflod proteiner, og mange kandidat protein biomarkers i humant plasma er innenfor dette området5. Dette problemet skyldes i stor grad den iboende bredt dynamisk område og kompleksiteten av menneskelig proteom6.
For å overvinne disse oppdagelsen utfordringene, immuno-MS metoder har blitt utviklet for å berike målet proteiner eller peptider fra eksempel løsninger på en solid overflate, etterfulgt av elueringsrør analytter og MS måling7,8 , 9 , 10. gjennom immuno-berikelse, analytter er renset fra komplekse eksempler og derfor ion-undertrykking effekten fra andre molekyler er minimert. Blant ulike solid støtter, er magnetiske perler for tiden mest brukt som de har fordelene av høy antistoff innbindingen behandlingskapasitet og bevegelighet. Magnetiske perler med forskjellige functionalizations og størrelser er utviklet og kommersialisert for immunoprecipitation eksperimenter. Hittil har immuno-berikelse på perler, tilkobles med både electrospray ionization (ESI) og MALDI-MS for protein og peptid måling. Stabil isotop standarder og fangst av anti-peptid antistoffer (SISCAPA) teknologi, er proteiner i prøvene fordøyd, etterfulgt av inkubasjon med antistoff perler for immuno-berikelse. I “klassisk” SISCAPA, er fanget proteotypic peptidene elut fra perler, og målt av flytende kromatografi-ESI-MULTIPLE Sclerosis (LC-MS), eller ved direkte infusjon ESI-flere reaksjon overvåking-MS (ESI-MRM-MS)11,12. Immuno-berikelse forbedret MRM analysen følsomheten av 3-4 størrelsesordener, nådde den lave ng/mL utvalg13.
Sammenlignet med electrospray-MULTIPLE Sclerosis, MALDI-MS er raskere, og innebærer ikke rengjøring og re balanse av LC kolonner slik at det ikke er noen carryover og forurensning problemer, noe som gjør det mer egnet for høy gjennomstrømming studier14. Immuno-MALDI teknologi har blitt utviklet i vårt laboratorium kombinere immuno-berikelse med MALDI-MS for sensitive og bestemt kvantifisering av peptider og proteiner (basert på kvantifisering av proteotypic peptider)15,16 ,17. Etter immuno-berikelse, perler settes på en MALDI mål plate matrix legges til perler og platen er klar for analyse av en MALDI-TOF-MS etter tørking. Elueringsrør av peptider fra perlene utføres ikke som et separat trinn, men affinitet-bundet analytter er elut av MALDI matrise løsningen når det legges til de perle flekkene, og dermed forenkle eksempel utarbeidelsen og minimere eksempel tap. IMALDI teknologien har vært brukt i en rekke programmer18,19, og nylig har vært automatisert og brukes for å måle Angiotensin jeg (Ang jeg) for å bestemme plasma renin aktivitet (PRA)20. Denne protokollen vil demonstrere prosedyren for å utføre automatiserte iMALDI analysen. Tar PRA analysen som et eksempel, mellom dag CVs på mindre enn 10% er oppnådd gjennom automatisering, med evne å måle 744 samplinger dag20.
IMALDI PRA analysen i dette manuskriptet krever ikke protein fordøyelse, som mål molekylet (Ang jeg) er et peptid med en molekylvekt på 1295.7 Da. I andre analyser der protein fordøyelse er nødvendig og et peptid brukes som surrogat for intakt protein, bør den valgte peptid for iMALDI være unike og spesielle mål protein, med en masse over 800 Da slik at det lett kan skilles fra c hemical støy fra MALDI matrise løsning. Anti-peptid antistoffer kreves for immuno-anriking av peptider. Protokollen for iMALDI analysen måle PRA består av fire trinn: 1) generasjon av Ang I humant plasma; 2) immuno-berikelse på Ang jeg bruker antistoff perler; 3) overføring av perler til en MALDI mål plate og legge matrix løsning; og 4) signal oppkjøpet av en MALDI-TOF-MULTIPLE Sclerosis og data analyse20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammenlignet med konvensjonelle baserte protein kvantifisering, bruker iMALDI antistoffer til å berike analytter og renser dem fra komplekse prøver, derfor gjør det mulig å kvantifisere proteiner eller peptider i lave konsentrasjoner. En avgjørende skritt i iMALDI protokollen er immuno-anriking av målet peptider. For dette formålet, skal antistoffer med stor detaljrikdom og affinitet velges. I SISCAPA, har det blitt rapportert at antistoff slektskap på 10-9 M eller bedre ville være nødvendig for å o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker for økonomisk støtte fra Genome Canada og genom British Columbia for operasjoner (204PRO) og teknologiutvikling (214PRO) gjennom genomet innovasjoner nettverk (GIN). Vi takker Drug Discovery Platform ved Research Institute i McGill University Health Center for bruk av MALDI-TOF instrumentet for filming. H.L. er takknemlig for støtte fra doc. fra National Science og Engineering Research Council for Canada (NSERC). C.H.B er takknemlig for støtte fra ledende Endowment Fund (LEEF). C.H.B. er takknemlig for støtte fra Segal McGill stolen i molekylær onkologi ved McGill University (Montreal, Quebec, Canada). M.X.C. og C.H.B. er takknemlig for støtte fra den Warren Y. Soper Charitable Trust og Alvin Segal Family Foundation til den jødiske General Hospital (Montreal, Quebec, Canada).
Materials
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients. Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).
- Webster, J., Oxley, D., Zanders, E. D. . Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. , 227-240 (2012).
- Yergey, A. L., et al. De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).
- Anderson, L. Six decades searching for meaning in the proteome. J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).
- Landegren, U., et al. Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis. Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation. Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate. Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).
- Fredolini, C., et al. Immunocapture strategies in translational proteomics. Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).
- Tran, J. C., et al. Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies. Anal. Chem. , (2016).
- Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow. N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).
- Razavi, M., et al. High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).
- Anderson, N. L., et al. SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device. Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).
- Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. Mass-spectrometry-based clinical proteomics – a review and prospective. The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).
- Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).
- Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II. Methods. 56 (2), 213-222 (2012).
- Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension. Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).
- Jiang, J., et al. Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis. Proteomics Clin Appl. 1, (2007).
- Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis. Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).
- Popp, R. An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).
- Schoenherr, R. M., et al. Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry. J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , (2011).
- Weiß, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).
- Nelson, A. L. Antibody fragments: Hope and hype. mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).
- Gupta, V., et al. An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein. Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).
