검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재
Summary
특정 대상 프로브 질병 (예를 들어, 염증, 감염, 및 tumorigenesis)의 다양 한 종류의 단백질 표정 등의 분자 메커니즘을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 연구에서 우리는 murine 모델 f 4/80 전용 형광 중재 단층 촬영을 사용 하 여 대 장 염의 장 대 식 세포 침투의 양적 차원 단층 평가 설명 합니다.
Abstract
질병의 murine 모델은 과학적 연구에 불가결. 그러나, 내 시경 검사 나 컴퓨터 단층 촬영 영상 등 많은 진단 도구는 정기적으로 동물 모델에서 채택 하지. 기존의 실험 판독 자주 내 개별 후속 시험을 방지 하 고 필요한 연구 동물의 수를 증가 하는 사후 고 비보 전 분석에 의존 합니다. 형광-중재 단층 형광 프로브의 비-침략 적, 반복, 양적, 3 차원 평가 수 있습니다. 매우 중요 한 특정 검색 및 고유한 분자 대상의 특성에 대 한 수 있는 분자 제조 업체의 사용 허가 하 고. 특히, 타겟된 프로브 염증, 자가 면역 질환, 감염, 혈관 질환, 셀 마이그레이션, tumorigenesis, 등에서 유전자 활성화 및 단백질 발현을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 문서에서는, 우리 단계별 지침을 제공이 정교한 이미징 기술에 vivo에서 탐지 및 (즉, f 4/80-긍정적인 대 식 세포 침투)의 널리 murine 모델에서 염증의 특성에 대 한 장 염증입니다. 이 기술은 또한 면역 세포 또는 줄기 세포 추적 같은 다른 연구 분야에서 사용할 수 있습니다.
Introduction
동물 모델 연구에서 널리 이용 된다 그리고 모니터 질병 활동과 활력, 몸 무게 변경의 정량화 등 혈액, 소변, 배설물의 분석에 많은 비-침략 적 절차 존재 한다. 그러나, 이들은 또한 간 개별 다양성에 적용 되는 간접 대리 매개 변수만 있습니다. 그들은 자주 조직 표본, 반복 시간 지점에서 직렬 관찰 방지의 사후 분석으로 보완 해야 한다 고 에 비보를 처리 하는 생리 적 또는 병 적인 관찰. 정교한 이미징 기술에 작은 동물 등장, 교차 단면 영상, 광학 이미징 및 내 시경, 이러한 프로세스의 직접적인 시각화를 가능 하 게 하 고 또한 같은 동물1 의 반복적인 분석에 대 한 허용을 포함 한 , 2 , 3. 또한, 반복적으로 같은 동물에 있는 질병의 다양 한 상태 모니터링에 동물 윤리의 관점에서 것 필요한 하는 동물의 수 저하 될 수 있습니다.
여러 다른 광학 이미징 기술을 형광 이미징 vivo에서 존재 한다. 원래, confocal 영상 표면과 표면 아래 형광 이벤트4,5공부를 고용 했다. 그러나 최근에,, 양적 3 차원 조직 평가 대 한 허용 하는 단층 촬영 시스템 개발된6되었습니다. 이 낮은 흡수, 민감한 탐지기와 단색 광원7근처-적외선 (NIR) 스펙트럼에서 빛을 방출 하는 형광 프로브 개발을 통해 성취 되었습니다. 전통적인 에칭한 이미징 기술을, 동안 같은 컴퓨터 단층 촬영 (CT), 자기 공명 영상 (MRI) 또는 초음파 (미국), 물리적에 주로 의존 하 고 시각화 형태학, 광학 이미징 제공할 수 있습니다 추가 정보 기본 분자 프로세스에8을프로브 생 또는 외 인 형광을 사용 합니다.
분자 생물학에서의 발전 목표의 증가 수에 대 한 스마트 하 고 타겟 형광 분자 프로브의 생성을 촉진 하기 위하여 왔다. 예를 들어 수용 체-중재 통풍 관 및 지정된 대상 지역에 배포 수 구상 될 carbocyanine 파생 표시 된 항 체9를 사용 하 여. 신체의 그렇지 않으면 액세스할 수 없는 영역에 특정 추적기 기능을 붙일 수는 사용 가능한 항 체의 풍부한 tumorigenesis, 신경의 모델에서 분자 및 세포 프로세스에 전례 없는 통찰력을 제공 심혈 관, 면 역학적, 그리고 염증 성 질병7.
이 연구에서 우리는 murine 모델 colitis의 단층 형광 중재를 사용 하 여를 설명합니다. Dextran 황산 나트륨 (DSS)-유도 대 장 염은 선 동적인 장 질병 (IBD)10유사한 창 자 염증의 화학적으로 유도 된 마우스 표준형. 특히 창 자 염증11의 개발에 타고 난 면역 체계의 기여를 평가 하기 위해 유용 합니다. 모집, 활성화, 및 monocytes 그리고 대 식 세포의 침투 IBD의 병 인에 중요 한 단계를 나타냅니다, 이후 그들의 신규 모집의 시각화 및 침투의 활동 모니터링, 예를 들어의 효과에 필수적입니다. 전 임상 설정12에 잠재적인 치료 물질. 우리는 DSS colitis의 유도 설명 하 고 monocyte/대 식 세포 마커 F4/80의 특정 시각화에 대 한 형광 분자 단층 촬영을 사용 하 여 창 자 점 막으로 대 식 세포 침투의 단층 촬영-중재 특성을 보여 13. 또한, 우리는 항 체 라벨; 등 보조 및 보완 절차를 설명 실험적인 체제; 그리고 분석 및 질병 활동 지 수 등 기존의 판독 상관 관계에서 얻은 이미지의 해석을 cytometry 및 조직학 분석과 immunohistochemistry 흐름. 우리는이 기술과 다른 이미지 형식에 대 한 비교의 한계를 논의.
Protocol
Representative Results
Discussion
의료 이미징 기술을 최근 몇 년 동안에서 급속 하 게 진화, 비록 우리는 여전히 개발의 그들의 초기 단계에서 염증 성 프로세스 또는 종양, 뿐만 아니라 다른 질병을 감지 하는 우리의 능력에 제한 됩니다. 그러나, 이것은 이해 종양 성장, 침략, 또는 전이 개발 및 염증 성 질환 및 퇴행 성, 심장 혈관과 면역 질병의 발달에서 세포 프로세스에 매우 중요. 전통적인 이미징 기술을 신체적 또는 생리 적 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 우수한 기술 지원에 대 한 양 소냐 Dufentester, 양 Elke 웨버와 부인 Klaudia Niepagenkämper 감사합니다.
Materials
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
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