JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Bio-ingénierie

Microfluidic Bioprinting for utvikling Stangeriaceae vev og Organoids

Published: August 11, 2017
doi:
10.3791/55957
, ,
1Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital,Harvard Medical School, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Renji Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Division of Pharmacology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences,Utrecht University

Summary

Vi tilbyr en generalisert protokoll basert på en microfluidic bioprinting strategi for tekniske en microfibrous vaskulære seng, hvor en sekundær celle type kan være ytterligere sådd i den interstitielle rommet med denne microfibrous strukturen til å generere Stangeriaceae vev og organoids.

Abstract

Utvikling Stangeriaceae vev konstruerer og organoids har vært historisk utfordrende. Her beskriver vi en ny metode basert på microfluidic bioprinting til å generere et stillas med flerlags interlacing hydrogel mikrofiber. For å oppnå jevn ble bioprinting, en kjerne-skjede microfluidic trykkhodet inneholder sammensatte bioink formulering heves fra kjernen flyten og crosslinking løsningen båret av sliren strømmen, designet og montert på bioprinter. Ved å blande gelatin methacryloyl (GelMA) med alginate, et polysakkarid som gjennomgår øyeblikkelig ioniske crosslinking i nærvær av Velg divalent ioner, etterfulgt av en sekundær photocrosslinking i komponenten GelMA å oppnå varig stabilisering, en microfibrous stillaset kan oppnås ved hjelp av denne bioprinting-strategien. Viktigere, kan endotelceller innkapslet inne bioprinted mikrofiber danne lumen-lignende strukturer som ligner på blodkar i løpet av kultur for 16 dager. Endothelialized microfibrous stillaset kan brukes som en vaskulær seng videre for å konstruere en vascularized vev gjennom etterfølgende såing av sekundær celle type i den interstitielle rommet av mikrofiber. Microfluidic bioprinting gir en generalisert strategi i praktisk engineering Stangeriaceae vev på Hi-Fi.

Introduction

Tissue engineering mål å generere funksjonelle vev erstatter som kan brukes til å erstatte, gjenopprette eller utvide disse skadet eller syke i menneskekroppen1,2,3,4, ofte gjennom en kombinasjon av ønsket celletyper, bioaktive molekyler5,6og biologisk materiale7,8,9,10. Flere nylig, vev engineering teknologi er også stadig vedtatt for å generere i vitro vev og organ modeller som etterligner viktige funksjoner av deres i vivo motparter, for programmer som narkotika utvikling, i erstatning av konvensjonelle over-forenklet plan celle kulturer11,12,13,14,15,16,17,18,19. I begge situasjoner, kunne recapitulate komplekse mikroarkitektur og hierarkisk struktur av menneskelig vev er kritisk i slik funksjonalitet av konstruert vev10, og spesielt måter å integrere en vaskulære nettverket i utvikling vev er etterspørsel siden endometrial blodkar presenterer en av de største utfordringene til feltet20,21,22,23.

Hittil har en rekke tilnærminger har blitt utviklet i denne forbindelse å bygge blod fartøy strukturer i utvikling vev konstruksjoner med ulike grader av suksessen8. For eksempel tillater selvstendig montering av endotelceller generering av mikrovaskulær nettverk24; levering av angiogenic vekstfaktorer induserer vedvarende neovascularization25,26; Bruk av vaskulær stamfar celler og pericytes forenkler endothelial cellevekst og montering24,27; utforme stillaset egenskaper gjør nøyaktig modulering av endometrial blodkar28,29; og celle ark teknologi gir mulighet for praktisk manipulasjon av vaskulær lagdeling30. Disse strategiene imidlertid ikke gi gave evnen til å kontrollere den romlige mønstre av blodkar, ofte fører til tilfeldig fordeling av blodkar i en konstruert vev konstruksjon og dermed begrenset reproduserbarhet. De siste årene har bioprinting dukket opp som en klasse av aktiveringsteknologier mot løsning av en slik utfordring, på grunn av sin enestående allsidighet av innskudd komplekse vev mønstre på Hi-Fi og reproduserbarhet en automatisert eller semi-automatisert måte31,32,33. Oppofrende bioprinting34,35,36,37,38, innebygd bioprinting39,40,41, og hul strukturen bioprinting/biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 har alle vist på muligheten å generere vaskulær eller Stangeriaceae vev.

Alternativt, en microfluidic bioprinting strategi å dikte microfibrous stillasene er nylig utviklet, der en hybrid bioink består av alginate og gelatin methacryloyl (GelMA) ble levert gjennom kjernen av en konsentrisk trykkhodet og veisalt (CaCl2) løsning ble gjennomført ytre skjede flyten av trykkhodet54,55. Co-ekstrudering av to renn tillatt for umiddelbar fysisk crosslinking av komponenten alginate å aktivere mikrofiber formasjon, mens påfølgende photocrosslinking sikret permanent stabilisering av flerlags microfibrous stillaset. Av notatet fant endotelceller innkapslet i bioprinted mikrofiber sprer og migrere mot utkanter av mikrofiber antar lumen-lignende strukturer som etterlignet vaskulær seng54,55. Disse bioprinted, endothelialized vaskulær senger kan deretter fylles med ønsket videregående celletyper ytterligere konstruere Stangeriaceae vev55. Denne protokollen gir dermed en detaljert prosedyre på slik microfluidic bioprinting strategi aktiveres av konsentriske munnstykke design, som sikrer praktisk fabrikasjon av Stangeriaceae vev for bruksmuligheter både tissue engineering og organoid modellering.

Protocol

Neonatal rotte cardiomyocytes brukes i denne protokollen ble isolert fra 2 dager gamle Sprague-Dawley rotter etter en veletablert prosedyren56 godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved Brigham and Women’s Hospital. 1. instrumentering av Bioprinter Sette inn en mindre sløv nål (f.eks, 27 G, 1 tomme) som kjernen i midten av en større sløv nål (f.eks, 18 G, ½ tomme) som skjede å konstruere tolags, konsentrisk microflu…

Representative Results

Microfluidic bioprinting strategien gir direkte ekstrudering bioprinting av microfibrous stillaser med lav viskositet bioinks54,55. Som vist i figur 2A, en stillaset størrelse 6 × 6 × 6 mm3 inneholder > 30 lag av mikrofiber kunne bioprinted i 10 min. Den umiddelbare ioniske crosslinking av komponenten alginate med CaCl2 tillatt for utmerket konstruksjonssi…

Discussion

Byggingen av ko-aksiale trykkhodet representerer et viktig skritt mot vellykket microfluidic bioprinting å tillate samtidig levering av både bioink fra kjernen og crosslinking agent av skjeden. Mens denne protokollen en eksempel trykkhodet ble opprettet med en 27G nål som kjernen og en 18G nål som skallet, kan det lett bli utvidet til en rekke kombinasjoner med forskjellige størrelser av nåler. Men vil endring i p størrelser, som resulterer i endringen flyt levert i hver fase, kreve ytterligere optimalisering av s…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne bekrefter National Cancer Institute av den nasjonale institutter for helse veien for uavhengighet Award (K99CA201603).

Materials

Alginic acid sodium salt from brown algae Sigma-Aldrich A0682 BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skin Sigma-Aldrich G2500 Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) Sigma-Aldrich 410896 98%
HEPES buffer Sigma-Aldrich H0887 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum  Thermo Fisher Scientific 10438026 Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001 Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001GFP GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth medium Lonza CC-3162 EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Thermo Fisher Scientific 12430054 High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Clear 0.5 kg Kit
UV curing lamp system Excelitas Technologies OmniCure S2000 Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  2. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P., Langer, R. Progress in Tissue Engineering. Sci. Am. 300 (5), 64-71 (2009).
  3. Langer, R. Tissue Engineering: Status and Challenges. E-Biomed: J.Regen. Med. 1 (1), 5-6 (2004).
  4. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering Complex Tissues. Sci. Transl. Med. 4 (160), 112 (2012).
  5. Biondi, M., Ungaro, F., Quaglia, F., Netti, P. A. Controlled Drug Delivery in Tissue Engineering. Adv. Drug Del. Rev. 60 (2), 229-242 (2008).
  6. Tayalia, P., Mooney, D. J. Controlled Growth Factor Delivery for Tissue Engineering. Adv. Mater. 21 (32-33), 3269-3285 (2009).
  7. Hubbell, J. A. Biomaterials in Tissue Engineering. Nat. Biotechnol. 13 (6), 565-576 (1995).
  8. Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in Biomaterials for Tissue Engineering. Nat. Mater. 8 (6), 457-470 (2009).
  9. Rice, J. J., et al. Engineering the Regenerative Microenvironment with Biomaterials. Adv. Healthcare Mater. 2 (1), 57-71 (2012).
  10. Zhang, Y. S., Xia, Y. Multiple Facets for Extracellular Matrix Mimicking in Regenerative Medicine. Nanomedicine. 10 (5), 689-692 (2015).
  11. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  12. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic Organs-on-Chips. Nat. Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  13. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-Chips at the Frontiers of Drug Discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
  14. Zhang, Y. S., Khademhosseini, A. Seeking the Right Context for Evaluating Nanomedicine: From Tissue Models in Petri Dishes to Microfluidic Organs-on-a-Chip. Nanomedicine. 10, 685-688 (2015).
  15. Zhang, C., Zhao, Z., Abdul Rahim, N. A., Van Noort, D., Yu, H. Towards a Human-on-Chip: Culturing Multiple Cell Types on a Chip with Compartmentalized Microenvironments. Lab Chip. 9 (22), 3185-3192 (2009).
  16. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A Focus on Compartmentalized Microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  17. Sung, J. H., et al. Microfabricated Mammalian Organ Systems and Their Integration into Models of Whole Animals and Humans. Lab Chip. 13 (7), 1201-1212 (2013).
  18. Wikswo, J. P. The Relevance and Potential Roles of Microphysiological Systems in Biology and Medicine. Exp. Biol. Med. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  19. Yum, K., Hong, S. G., Healy, K. E., Lee, L. P. Physiologically Relevant Organs on Chips. Biotechnol. J. 9 (1), 16-27 (2014).
  20. Nomi, M., Atala, A., Coppi, P. D., Soker, S. Principals of Neovascularization for Tissue Engineering. Mol. Aspects Med. 23 (6), 463-483 (2002).
  21. Jain, R. K., Au, P., Tam, J., Duda, D. G., Fukumura, D. Engineering Vascularized Tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 821-823 (2005).
  22. Rouwkema, J., Rivron, N. C., Van Blitterswijk, C. A. Vascularization in Tissue Engineering. Trends Biotechnol. 26 (8), 434-441 (2008).
  23. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Sci. Transl. Med. 4 (160), 123 (2012).
  24. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
  25. Perets, A., et al. Enhancing the Vascularization of Three-Dimensional Porous Alginate Scaffolds by Incorporating Controlled Release Basic Fibroblast Growth Factor Microspheres. J. Biomed. Mater. Res. A. 65 (4), 489-497 (2003).
  26. Davies, N. H., Schmidt, C., Bezuidenhout, D., Zilla, P. Sustaining Neovascularization of a Scaffold through Staged Release of Vascular Endothelial Growth Factor-A and Platelet-Derived Growth Factor-BB. Tissue Eng. A. 18 (1-2), 26-34 (2012).
  27. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Influence of Adult Mesenchymal Stem Cells on in Vitro Vascular Formation. Tissue Eng. A. 15 (7), 1751-1761 (2009).
  28. Quint, C., et al. Decellularized Tissue-Engineered Blood Vessel as an Arterial Conduit. Proct. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (22), 9214-9219 (2011).
  29. Choi, S. -. W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in Biodegradable Inverse Opal Scaffolds with Uniform and Precisely Controlled Pore Sizes. Adv. Healthcare Mater. 2 (1), 145-154 (2013).
  30. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of Three-Dimensional Vascularized Cardiac Tissue with Cell Sheet Engineering. J. Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  31. Zhang, Y. S., et al. 3D Bioprinting for Tissue and Organ Fabrication. Ann. Biomed. Eng. 45 (1), 148-163 (2017).
  32. Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv. Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  33. Murphy, S. V., Atala, A. 3d Bioprinting of Tissues and Organs. Nat. Biotechnol. 32 (8), 773-785 (2014).
  34. Miller, J. S., et al. Rapid Casting of Patterned Vascular Networks for Perfusable Engineered Three-Dimensional Tissues. Nat. Mater. 11 (9), 768-774 (2012).
  35. Bertassoni, L. E., et al. Hydrogel Bioprinted Microchannel Networks for Vascularization of Tissue Engineering Constructs. Lab Chip. 14 (13), 2202-2211 (2014).
  36. Kolesky, D. B., et al. 3d Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  37. Lee, V. K., et al. Creating Perfused Functional Vascular Channels Using 3d Bio-Printing Technology. Biomaterials. 35 (28), 8092-8102 (2014).
  38. Zhang, Y. S., et al. Bioprinted Thrombosis-on-a-Chip. Lab Chip. 16, 4097-4105 (2016).
  39. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the Granular Gel Medium. Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).
  40. Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3d Printing of Shear-Thinning Hydrogels into Self-Healing Hydrogels. Adv. Mater. 27 (34), 5075-5079 (2015).
  41. Hinton, T. J., et al. Three-Dimensional Printing of Complex Biological Structures by Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
  42. Jia, W., et al. Direct 3d Bioprinting of Perfusable Vascular Constructs Using a Blend Bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  43. Zhang, Y., et al. In Vitro Study of Directly Bioprinted Perfusable Vasculature Conduits. Biomaterials Science. 3 (1), 134-143 (2015).
  44. Gao, Q., He, Y., Fu, J. -. Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial Nozzle-Assisted 3D Bioprinting with Built-in Microchannels for Nutrients Delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  45. Cornock, R., Beirne, S., Thompson, B., Wallace, G. G. Coaxial Additive Manufacture of Biomaterial Composite Scaffolds for Tissue Engineering. Biofabrication. 6 (2), 025002 (2014).
  46. Duan, B., Hockaday, L. A., Kang, K. H., Butcher, J. T. 3D Bioprinting of Heterogeneous Aortic Valve Conduits with Alginate/Gelatin Hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. A. 101 (5), 1255-1264 (2013).
  47. Skardal, A., et al. Photocrosslinkable Hyaluronan-Gelatin Hydrogels for Two-Step Bioprinting. Tissue Eng. A. 16 (8), 2675-2685 (2010).
  48. Li, S., et al. Direct Fabrication of a Hybrid Cell/Hydrogel Construct by a Double-Nozzle Assembling Technology. J. Bioact. Compatible Polym. 24 (3), 249-265 (2009).
  49. Visser, J., et al. Biofabrication of Multi-Material Anatomically Shaped Tissue Constructs. Biofabrication. 5 (3), 035007 (2013).
  50. Boyd, D. A., Adams, A. A., Daniele, M. A., Ligler, F. S. Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape. Journal of visualized experiments: JoVE. (83), e50958 (2014).
  51. Daniele, M. A., Adams, A. A., Naciri, J., North, S. H., Ligler, F. S. Interpenetrating Networks Based on Gelatin Methacrylamide and Peg Formed Using Concurrent Thiol Click Chemistries for Hydrogel Tissue Engineering Scaffolds. Biomaterials. 35 (6), 1845-1856 (2014).
  52. Daniele, M. A., Boyd, D. A., Adams, A. A., Ligler, F. S. Microfluidic Strategies for Design and Assembly of Microfibers and Nanofibers with Tissue Engineering and Regenerative Medicine Applications. Adv. Healthcare Mater. 4 (1), 11-28 (2015).
  53. Daniele, M. A., Radom, K., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfluidic Fabrication of Multiaxial Microvessels Via Hydrodynamic Shaping. RSC Advances. 4 (45), 23440-23446 (2014).
  54. Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low Viscosity Bioink. Adv. Mater. 28 (4), 677-684 (2015).
  55. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting 3D Microfibrous Scaffolds for Engineering Endothelialized Myocardium and Heart-on-a-Chip. Biomaterials. 110, 45-59 (2016).
  56. Khademhosseini, A., et al. Microfluidic Patterning for Fabrication of Contractile Cardiac Organoids. Biomed. Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
  57. Yue, K., et al. Synthesis, Properties, and Biomedical Applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) Hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  58. Loessner, D., et al. Functionalization, Preparation and Use of Cell-Laden Gelatin Methacryloyl-Based Hydrogels as Modular Tissue Culture Platforms. Nat. Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  59. Aung, A., Theprungsirikul, J., Lim, H. L., Varghese, S. Chemotaxis-Driven Assembly of Endothelial Barrier in a Tumor-on-a-Chip Platform. Lab Chip. 16, 1886-1898 (2016).
  60. Shin, S. R., et al. A Bioactive Carbon Nanotube-Based Ink for Printing 2d and 3d Flexible Electronics. Adv. Mater. 28 (17), 3280-3289 (2016).
  61. Shin, S. R., et al. Aptamer-Based Microfluidic Electrochemical Biosensor for Monitoring Cell Secreted Cardiac Biomarkers. Anal. Chem. 88, 10019-10027 (2016).
  62. Zhang, Y. S., et al. Google Glass-Directed Monitoring and Control of Microfluidic Biosensors and Actuators. Sci. Rep. 6, 22237 (2016).
  63. Colosi, C., et al. Rapid Prototyping of Chitosan-Coated Alginate Scaffolds through the Use of a 3d Fiber Deposition Technique. J. Mater. Chem. B. 2 (39), 6779-6791 (2014).
  64. Zhu, W., et al. Direct 3D Bioprinting of Prevascularized Tissue Constructs with Complex Microarchitecture. Biomaterials. 124, 106-115 (2017).
  65. Yu, Y., Zhang, Y., Martin, J. A., Ozbolat, I. T. Evaluation of Cell Viability and Functionality in Vessel-Like Bioprintable Cell-Laden Tubular Channels. J. Biomech. Eng. 135 (9), 091011-091011 (2013).
  66. Zhang, Y., Yu, Y., Chen, H., Ozbolat, I. T. Characterization of Printable Cellular Micro-Fluidic Channels for Tissue Engineering. Biofabrication. 5 (2), 025004 (2013).
  67. Zhang, Y., Yu, Y., Ozbolat, I. T. Direct Bioprinting of Vessel-Like Tubular Microfluidic Channels. J. Nanotechnol. Eng. Med. 4 (2), 020902 (2013).
  68. Dolati, F., et al. In Vitro Evaluation of Carbon-Nanotube-Reinforced Bioprintable Vascular Conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101 (2014).
  69. Hansen, C. J., et al. High-Throughput Printing Via Microvascular Multinozzle Arrays. Adv. Mater. 25 (1), 96-102 (2013).

Tags

Keywords: Microfluidic BioprintingOrganoidsVascular VatLiverSkinCancerBioprinterAlginateGelMAPhotoinitiatorHEPES BufferFBSCalcium ChlorideHUVECsDual Channel Syringe PumpCrosslinking
check_url/fr/55957?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Zhang, Y. S., Pi, Q., van Genderen, A. M. Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids. J. Vis. Exp. (126), e55957, doi:10.3791/55957 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image