Simuleras Bioprinting för Engineering vaskulariserad vävnad och Organoids

Summary

Vi tillhandahåller en generaliserad protokoll baserat på en mikroflödessystem bioprinting strategi för ingenjörsvetenskap en microfibrous vaskulär säng, där en sekundär celltyp kunde vara ytterligare seedade i interstitiell utrymme av denna microfibrous struktur att generera vaskulariserad vävnad och organoids.

Abstract

Engineering vaskulariserad vävnad konstruerar och organoids har varit historiskt utmanande. Här beskriver vi en ny metod baserad på mikroflödessystem bioprinting att generera en byggnadsställning med multilayer sammanflätning hydrogel mikrofibrer. För att uppnå jämn bioprinting, en core-slida mikroflödessystem skrivhuvudet som innehåller en sammansatt bioink formulering extruderade från core flödet och crosslinking lösningen bärs av slida flödet, ritades och monteras på bioprinter. Genom att blanda gelatin methacryloyl (GelMA) med alginat, en polysackarid som genomgår momentana Joniska crosslinking i närvaro av Välj tvåvärda joner, följt av en sekundär photocrosslinking av komponenten GelMA att uppnå permanent stabilisering, en microfibrous byggnadsställning kunde erhållas med hjälp av denna bioprinting strategi. Ännu viktigare, kan endotelceller inkapslade inuti den bioprinted mikrofibrer bilda lumen-liknande strukturer som liknar vaskulatur under loppet av kultur för 16 dagar. Endothelialized microfibrous ställningen kan användas ytterligare en vaskulär Bed för att konstruera en vaskulariserad vävnad genom efterföljande sådd av sekundär celltyp in i interstitiell utrymme av mikrofibrer. Simuleras bioprinting ger en generaliserad strategi i bekväm konstruktion av vaskulariserad vävnad på HiFi.

Introduction

Tissue engineering mål att generera fungerande vävnad substitut som kan användas för att ersätta, återställa eller öka de skadade eller sjuka människokroppen^1,2,3,4, ofta genom en kombination av önskade celltyper, bioaktiva molekyler^5,6och biomaterial^7,8,9,10. Mer nyligen, tissue engineering teknik har också alltmer antagits för att generera in vitro- vävnads- och modeller som efterliknar de viktiga funktionerna i sina i vivo motsvarigheter, för applikationer såsom läkemedelsutveckling, som ersättning för konventionella alltför förenklade planar cell kulturer^{11,12,13,14,15,16,17,18,19}. I båda situationerna, förmågan att sammanfatta de komplexa mikroarkitektur och hierarkiska strukturen i de mänskliga vävnaderna är avgörande för att aktivera funktionen den bakåtkompilerade vävnader¹⁰och sätt att integrera en vaskulär nätverk i bakåtkompilerade vävnader är särskilt efterfrågan eftersom vaskularisering presenterar en av de största utmaningarna för den fält^20,21,22,23.

Hittills har en mängd metoder har utvecklats i detta avseende i ett försök att bygga blodkärl strukturer i bakåtkompilerade vävnad konstruktioner med varierande grader av framgång⁸. Till exempel möjliggör självmontering av endotelceller generering av mikrovaskulära nätverk²⁴; leverans av angiogena tillväxtfaktorer inducerar ihållande kärlnybildning^25,26. använda av vaskulär stamceller och pericyter underlättar endotelcellstillväxt och montering^24,27. utforma byggnadsställning egenskaper möjliggör exakt modulering av vaskularisering^28,29; och cell ark teknik möjliggör bekväm manipulation av vaskulär skiktning³⁰. Dock ger dessa strategier inte möjlighet att styra det rumsliga mönstringen av kärlsystemet, ofta leder till slumpmässiga fördelningen av blodkärl inom en konstruerad vävnad konstruera och därmed begränsad reproducerbarhet. Under de senaste åren har bioprinting vuxit fram som en klass av möjliggörande teknik mot lösningen av en utmaning, på grund av deras oöverträffade mångsidigheten hos insättning komplex vävnad mönster på HiFi och reproducerbarhet i ett automatiskt eller halvautomatiskt sätt^31,32,33. Uppoffrande bioprinting^{34,35,36,37,38}, inbäddade bioprinting^39,40,41och ihåliga struktur bioprinting/biofabrication^{42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53} har alla visat möjligheten att generera vaskulär eller vaskulariserad vävnad.

Alternativt, en mikroflödessystem bioprinting strategi att fabricera microfibrous ställningar har utvecklats nyligen, där en hybrid bioink består av alginat och gelatin methacryloyl (GelMA) levererades genom kärnan i en koncentrisk skrivhuvudet och en kalciumklorid (CaCl₂) lösning Bars genom yttre skidan flödet av skrivhuvudet^54,55. Den co-extrudering av två flöden tillåtet för omedelbar fysisk crosslinking av komponenten alginat att möjliggöra bildandet av microfiber, medan efterföljande photocrosslinking säkerställt permanent stabilisering av multi-layer microfibrous ställningen. Notera konstaterades endotelceller inkapslade i den bioprinted mikrofibrer att föröka sig och migrera mot periferin av den mikrofibrer förutsatt att lumen-liknande strukturer som härmade den vaskulära säng^54,55. Dessa bioprinted, endothelialized kärlbäddar kunde därefter fyllas med önskas sekundär celltyper att ytterligare bygga vaskulariserad vävnad⁵⁵. Detta protokoll ger således ett detaljerat förfarande av sådan en mikroflödessystem bioprinting strategi som koncentriskt munstycke design, vilket garanterar bekväm tillverkning av vaskulariserad vävnad för potentiella tillämpningar inom både vävnadsteknik och organoid modellering aktiverad.

Protocol

Neonatal råtta hjärtmuskelcellerna används i detta protokoll var isolerade från 2 dagar gamla Sprague-Dawley-råttor efter en väletablerad förfarande56 godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén vid Brigham and Women’s Hospital. 1. instrumentering av Bioprinter Infoga en mindre trubbig nål (t.ex., 27 G, 1 tum) som kärnan i centrum av en större trubbig nål (t.ex., 18 G, ½ tum) som slidan att konstruera den …

Representative Results

Strategin mikroflödessystem bioprinting möjliggör direkt extrudering bioprinting av microfibrous ställningar med låg viskositet bioinks54,55. Som illustreras i figur 2A, en byggnadsställning med en storlek på 6 × 6 × 6 mm3 innehållande > 30 lager av mikrofibrer kan vara bioprinted inom 10 min. Den omedelbara Joniska crosslinking av komponenten alginat med CaCl…

Discussion

Byggandet av co-axial skrivhuvudet utgör ett kritiskt steg mot framgångsrika mikroflödessystem bioprinting för samtidig leverans av både bioink från kärnan och crosslinking agent från slidan. Medan detta protokoll skapades ett exempel skrivhuvudet med en 27G nål som kärnan och en 18G nål som skalet, kan det lätt förlängas till en mängd olika kombinationer med hjälp av nålar i olika storlekar. Ändring i nål längder, vilket resulterar i förändring av mängden flöde levereras i varje fas, kommer dock …

Materials

Alginic acid sodium salt from brown algae	Sigma-Aldrich	A0682	BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)	Sigma-Aldrich	410896	98%
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10438026	Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C5080	BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cells	Angio-Proteomie	cAP-0001	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells	Angio-Proteomie	cAP-0001GFP	GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth medium	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	12430054	High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Clear 0.5 kg Kit
UV curing lamp system	Excelitas Technologies	OmniCure S2000	Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor