Etablere to motstand mot EGFR-TKI og MØTTE-TKI i lunge Adenocarcinoma celler In Vitro med en 2-trinns doseopptrapping prosedyre
Summary
En i vitro metode for å etablere to motstand mot en EGFR-TKI og en MET-TKI i kreftcellene er beskrevet. Denne metoden er nyttig for utvikle behandlinger for pasienter med EGFR-mutasjoner, som viser sykdomsprogresjon til tross for EGFR-TKI behandling med MET-forsterkning. Det kan også endres for hemmere målretting andre molekyler.
Abstract
Resistens er en stor utfordring i kreft terapi. Generering av motstandsdyktig sublines i vitro er nødvendig for å oppdage nye mekanismer for å mestre denne utfordringen. Her, en 2-trinns doseopptrapping metode for å etablere to-motstand mot en epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR)-tyrosin kinase inhibitor (TKI), gefitinib og en MET-TKI, PHA665752, er beskrevet. Denne metoden er basert på enkel gradvis doseopptrapping av hemmere for å indusere ervervet motstand i linjer. Den alternative metoden for å generere motstandsdyktig sublines innebærer utsette cellene for høye konsentrasjoner av hemmer i ett trinn. Gradvis doseopptrapping metoden har en høyere muligheten for vellykket inducing ervervet motstand enn denne metoden. Aktivere EGFR er mutasjoner biomarkers av en respons på behandling med EGFR-TKI, som er en brukt første linje behandling for ikke-småcellet lungekreft kreft (NSCLC) som havn disse mutasjonene. Men til tross for rapporter av effektive tiltak er bruk av EGFR-TKI begrenset fordi svulster uunngåelig erverve motstand. Store mekanismene bak EGFR-TKI motstand inkluderer en sekundær mutasjon på gatekeeper området, T790M i ekson 20 av EGFR og et omkjøringsvei signal på MET. Dermed vil en mulig løsning for dette problemet være en kombinasjon av EGFR-TKI og MET-TKI. Denne kombinerte behandlingen har vist seg å være effektive i en i vitro studier modell. Ervervet gefitinib-motstand ble etablert gjennom MET-forsterkning av gradvis doseopptrapping av gefitinib 12 måneder, og en celle linje kalt PC-9MET1000 ble generert i en tidligere studie. For ytterligere å undersøke mekanismene av ervervet MET-TKI og EGFR-TKI ble motstand, en MET-TKI, PHA665752, gitt til disse cellene med gradvis doseopptrapping i nærvær av gefitinib i 12 måneder. Denne protokollen har også vært anvendt for en rekke kombinasjon terapi for å etablere ervervet motstand mot andre hemmer molekyler.
Introduction
Kreftfremkallende mutasjoner i epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) finnes i et delsett av pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og er viktig prediktiv biomarkers av denne sykdommen1,2. Disse aktivering EGFR mutasjoner oftest opptrer som en i-ramme sletting i ekson 19 (delE746-A750) eller en punkt mutasjon erstatte leucine med arginine på codon 858 av ekson 21 (L858R) i EGFR tyrosin kinase domene3,4. Behandling med EGFR-tyrosin kinase hemmere (TKIs) er en klinisk effektiv terapi for pasienter med NSCLC skjuler EGFR mutasjoner. Men er denne behandlingen begrenset av uunngåelig oppkjøpet av motstand mot EGFR-TKIs som gefitinib og erlotinib. Den vanligste ervervede motstanden skjer via en sekundær T790M mutasjon i ekson 20 av EGFR, som ble oppdaget i ca 60% av pasienter som fikk EGFR-TKI (gefitinib eller erlotinib) motstand. Andre molekylære mekanismer knyttet ervervet motstand mot EGFR-TKIs er aktivisering omkjøringsvei signalnettverk forårsaket av MET forsterkning, transformasjonen av småcellet lunge kreft og epithelial til mesenchymal overgang5,6. Reseptoren for hepatocyte vekst faktor, kodet av MET genet, som er dysregulatedin mange svulster, har blitt rapportert å være en viktig kandidat for målrettet terapi7,8.
Strategier for å overvinne ervervet motstanden mot EGFR-TKIs er nå under klinisk evaluering. Prekliniske og kliniske studier har vist at tredjegenerasjons EGFR hemmere som osimertinib er effektivt for pasienter med T790M mutasjon9. I tillegg kan veksten av EGFR-mutant kreft med MET forsterkning bli hemmet av kombinert behandling med EGFR og MET TKIs6,10. Kliniske studier vurdere en kombinasjon av MET og EGFR hemmere hos pasienter med ervervet motstand mot gefitinib og erlotinib er i gang nå11.
For å studere molekylære mekanisme ervervet motstand mot chemotherapeutic agenter, behandles linjer som først svare hemmere kontinuerlig med disse hemmere. To metoder er tilgjengelig å etablere ervervet motstand i linjer. En er gradvis doseopptrapping, og den andre er high-konsentrasjon eksponering. Metoden gradvis opptrapping har blitt mer vanlig, fordi den har en høyere suksessrate. Cellene først utsatt til lave konsentrasjoner av hemmere, nesten en tidel av halv maksimal inhibitoriske konsentrasjon (IC50) verdien, og konsentrasjonen er deretter gradvis økt med 10-30% til målet konsentrasjonen er oppnådd. Den høye-Konsentrasjon eksponering metoden innebærer utsette cellene til siste dose av hemmer i kultur medium, som er mer enn verdien for IC-50 , så foreldre cellene er nesten helt drept. Denne høy-konsentrasjon eksponering metoden har mye en lavere suksessrate enn metoden gradvis opptrapping.
I en tidligere studie viste kombinert behandling med EGFR-TKI og MET-TKI seg å være effektive i en i vitro system. Ervervet motstand mot en EFGR-TKI, gefitinib, ble etablert gjennom gradvis Opptrapping i 12 måneder, sammen med MET forsterkere, og dermed en gefitinib-resistente cellen linje som kalles PC-9MET1000 ble generert12.
Protokollen presenteres her er en totrinns doseopptrapping prosedyre for å få EGFR-mutert NSCLC PC-9 celler med dobbel motstand mot EGFR-TKI, gefitinib og en MET-TKI, PHA665752 (figur 1). Denne metoden for å etablere ervervet motstandsdyktig i linjer er relativt lett å utføre, med høy suksessrate. Beskrevet protokollen kan endres for programmet med hemmere av andre molekylære mål narkotika og cytotoksiske agenter også.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her kan brukes for etablering av ervervet dual-motstand i kreftceller ved hjelp av en 2-trinns doseopptrapping metoden i vitro. Mange forskningsartikler har rapportert at PC-9 celler utviklet EGFR-TKI (gefitinib eller erlotinib) motstand gjennom T790M EGFR mutasjoner15,16. Men finner vi T790M mutasjoner i ekson 20 av våre PC-9MET1000 celler av direkte sekvensering (figur 4C). Videre ble MET forsterknin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer av Institutt for molekylær onkologi for sine gjennomtenkte kommentarer og nyttige råd, og Editage for deres hjelp med engelsk redigering. Dette arbeidet ble støttet av programmet MEXT støttes for strategisk Research Foundation ved Private universiteter (2012-2016) fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. Tohru Ohmori mottatt forskningsmidler (2015-2016) fra Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Tyskland).
Materials
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
- Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).
- Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
- Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from “never smokers” and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
- Mitsudomi, T., et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).
- Schmidt, L., et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).
- Olivero, M., et al. Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).
- Bean, J., et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).
- . NCT02468661 – ClinicalTrials.gov Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661 (2017)
- Yamaoka, T., et al. Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation. Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Cifone, M. A., Fidler, I. J. Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).
- Ercan, D., et al. Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor. Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).
- Ogino, A., et al. Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).
- Ando, K., et al. Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).
- Suda, K., et al. Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer. Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).
- Shien, K., et al. Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells. Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).
- Sagawa, Y., et al. Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure. Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).
- Ritter, C. A., et al. Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network. Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).
