Embryogenesis Arabidopsis में निस्र्पक के लिए एक विधि
Summary
इस प्रोटोकॉल में Arabidopsis embryogenesis बीजांड निकासी एक खुर्दबीन के नीचे भ्रूण पैटर्न गठन के निरीक्षण के बाद के माध्यम से देख के लिए एक विधि की रूपरेखा।
Abstract
उनके विकास की अत्यधिक उम्मीद के मुताबिक प्रकृति को देखते हुए Arabidopsis भ्रूण एक मॉडल के रूप में पौधों में morphogenesis के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, प्रारंभिक चरण संयंत्र भ्रूण छोटे हैं और कुछ कक्षों, उन्हें निरीक्षण और विश्लेषण करने के लिए मुश्किल बना रही हैं। एक विधि यहाँ पैटर्न गठन मॉडल जीव Arabidopsisका उपयोग कर एक खुर्दबीन के नीचे संयंत्र भ्रूण में निस्र्पक के लिए वर्णन किया गया है। निकासी ताजा बीजाणु के Hoyer के समाधान का उपयोग कर के, बाद में सेल नंबर और भ्रूण की आकारिकी मनाया जा सकता है, और उनके विकास के चरण एक 100 X तेल विसर्जन लेंस का उपयोग कर अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया जा सका। इसके अलावा, विशिष्ट मार्कर प्रोटीन ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP साथ) टैग की अभिव्यक्ति सेल पहचान विनिर्देश भ्रूण patterning के दौरान एनोटेट करने के लिए confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर द्वारा निगरानी की थी। इस प्रकार, इस विधि में जंगली-प्रकार संयंत्र भ्रूण सेलुलर और आणविक स्तरों पर पैटर्न गठन का निरीक्षण करने के लिए, और पैटर्न गठन जंगली प्रकार के पौधों और भ्रूण घातक म्यूटेंट से भ्रूण में तुलना करके भ्रूण patterning में विशिष्ट जीन की भूमिका विशेषताएँ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इसलिए, विधि Arabidopsisमें embryogenesis विशेषताएँ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।
Introduction
Embryogenesis उच्च संयंत्र विकास में जल्द से जल्द घटना है। एक परिपक्व भ्रूण रूपों एक युग्मनज कोशिका विभाजन और भेदभाव सख्त आनुवंशिक नियंत्रण1,2के माध्यम से। Arabidopsis भ्रूण morphogenesis के नियंत्रण क्योंकि एक उम्मीद पैटर्न3,4embryogenesis के दौरान सेल प्रभागों के अनुक्रम इस प्रकार अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल हैं। हालांकि, कई कक्षों के लिए एक युक्त एक Arabidopsis भ्रूण मनाया और विश्लेषण के लिए बहुत छोटी है। इसके अलावा, कुछ जीनों के उत्परिवर्तन भ्रूण मारक5embryogenesis में उन जीनों की महत्वपूर्ण भूमिका का संकेत, हो सकता है। भ्रूण-घातक म्यूटेंट में पैटर्न गठन के लक्षण वर्णन जिसके तहत भ्रूण विकास आवश्यक जीनों को विनियमित आणविक तंत्र को समझने के लिए एक आधार प्रदान करता है।
एक विस्तृत विधि यहाँ मॉडल संयंत्र Arabidopsis में भ्रूण पैटर्न गठन के लक्षण वर्णन के लिए प्रत्यक्ष सूक्ष्म अवलोकन द्वारा वर्णित है। विधि एक भ्रूण का सूक्ष्म अवलोकन द्वारा पीछा किया बीजांड मंजूरी शामिल है। एक भ्रूण घातक उत्परिवर्ती के लक्षण वर्णन भी वर्णन किया गया है।
विभिन्न विकासात्मक चरणों पर भ्रूण के morphology सीधे माइक्रोस्कोपी Hoyer के समाधान6,7के साथ मंजूरी दे दी गई है बीजाणु के प्रयोग द्वारा निर्धारित किया जा सकता। ऐसे बीजाणु के एक उच्च अपवर्तक सूचकांक प्रदर्शन; इस प्रकार, इस विधि समाशोधन बीजांड नमूनों कि अंतर हस्तक्षेप (डीआइसी) के विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जाना चाहिए के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है।
इसके अलावा, जीन है कि embryogenesis के दौरान व्यक्त किया जाता है एक विशेष कक्ष या कक्षों की एक सीमित संख्या में मार्कर के रूप में एक भ्रूण में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इसलिए, कक्ष पहचान विनिर्देश embryogenesis दौरान confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर का उपयोग मार्कर GFP-टैग किए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति निगरानी द्वारा एनोटेट कर सकते हैं। इसके विपरीत, अभिव्यक्ति के पैटर्न के एक अज्ञात कार्यात्मक जीन –GFP फ्यूजन embryogenesis के दौरान देख सकते हैं भ्रूण patterning और उस जीन की अभिव्यक्ति के बीच एक लिंक उपलब्ध कराने, और Arabidopsisमें embryogenesis के लिए आवश्यक हैं नए जीनों की पहचान की सुविधा।
यहाँ वर्णित विधि भी एक भ्रूण घातक उत्परिवर्ती के phenotype विशेषताएँ करने के लिए, और सेलुलर स्तर पर embryogenesis पर प्रभावित जीन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इसके अलावा, मार्कर जीन की अभिव्यक्ति पद्धति के साथ संयोजन में एक तुलना जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती पौधों के बीच embryogenesis के दौरान, आणविक तंत्र और संकेतन पथ embryogenesis8,9में शामिल बारे में सुराग विधि उपज कर सकते हैं। दरअसल, विधि naa10 पौधों के लिए लागू किया गया था, और यह पाया गया कि hypophysis में उत्परिवर्ती का असामान्य विभाजन embryogenesis5के दौरान ऒक्झिन्स के वितरण में परिवर्तन के द्वारा कारण हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
बीजांड निकासी कोशिका विभाजन का पता लगाने और Arabidopsisमें embryogenesis के दौरान आकारिकी का आकलन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है; इस तकनीक का उपयोग कर, भ्रूण सीधे डीआइसी माइक्रोस्कोपी5,12के तहत …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम dr. जेसिका उत्तर समीक्षकों की पांडुलिपि पढ़ने के लिए धन्यवाद। हम इमेजिंग सेंटर, जीवन विज्ञान, राजधानी नॉर्मल यूनिवर्सिटी (बीजिंग, चीन), कॉलेज के डॉ Xianyong शेंग DR5-GFP परख का स्थानीयकरण करने के लिए धन्यवाद। यह काम नगर निगम सरकार बीजिंग विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (सीआईटी & TCD20150102) और राष् ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन के चीन से (31600248)।
Materials
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495-555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-ml tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-ml tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment | ||
References
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