En metode for å karakterisere Embryogenesis i Arabidopsis
Summary
Denne protokollen definerer en metode for å observere embryogenesis i Arabidopsis via ovule klaring etterfulgt av inspeksjon av embryoet mønster formasjon under et mikroskop.
Abstract
Gitt svært forutsigbar natur deres utvikling, har Arabidopsis embryoer blitt brukt som modell for studier av morphogenesis i planter. Men tidlig stadium anlegget embryo er små og inneholder noen celler, noe som gjør dem vanskelig å observere og analysere. En metode beskrives her for å karakterisere mønster formasjonen i anlegget embryoer under et mikroskop med modell organismen Arabidopsis. Etter klarering av fersk ovules bruker Høyers løsning, celle nummer i og morfologi av embryo kunne observeres og deres utviklingsstadiet kunne bestemmes av differensial forstyrrelser kontrast mikroskopi bruker en 100 X olje nedsenking linsen. I tillegg ble uttrykk for spesifikk markør proteiner merket med grønt fluorescerende Protein (GFP) overvåket for å kommentere celle identitet spesifikasjoner under embryoet mønstre av AC confocal mikroskopi for laserskanning. Denne metoden kan dermed brukes å observere mønster formasjonen i vill-type anlegg embryoer på mobilnettet og molekylære og å karakterisere rollen til bestemte gener i fosteret mønstre ved å sammenligne mønster formasjonen i embryoer fra vill-type planter og embryo-dødelige mutanter. Metoden kan derfor brukes som karakteriserer embryogenesis i Arabidopsis.
Introduction
Embryogenesis er den første hendelsen i høyere anlegget utvikling. En moden embryoet former fra en zygote gjennom celledeling og differensiering under streng genetisk kontroll1,2. Arabidopsis embryoer er en nyttig modell å studere kontroll av morphogenesis fordi en rekke celledelinger under embryogenesis følger en forventet mønster3,4. Men er et Arabidopsis embryo som inneholder ett til flere celler for liten til å være observert og analysert. I tillegg kan mutasjon av visse gener forårsake embryoet dødelighet5, som indikerer en nøkkelrolle av de genene i embryogenesis. Karakterisering av mønster formasjon i embryo-dødelige mutanter gir et grunnlag for å forstå den molekylære mekanismen hvor viktig gener regulere embryo utvikling.
En detaljert metode beskrives her for karakterisering av embryoet mønster formasjonen i modellen fabrikken Arabidopsis av direkte mikroskopiske observasjon. Metoden innebærer ovule klaring etterfulgt av mikroskopiske observasjon av et embryo. Karakterisering av en embryo-dødelige mutant er også beskrevet.
Morfologi av embryo på ulike utviklingsstadier kan bestemmes direkte av mikroskopi bruker ovules som er avklart med Høyers løsning6,7. Slike ovules viser en høy brytningsindeks; Dermed er denne ovule clearing metode spesielt fordelaktige for prøver som må følges av differensial forstyrrelser kontrast (DIC) mikroskopi.
Gener som er uttrykt i en bestemt celle eller et begrenset antall celler under embryogenesis kan i tillegg brukes som markører for å identifisere cellene i et embryo. Derfor kan celle identitet spesifikasjonen under embryogenesis kommenteres ved å overvåke uttrykket GFP-merket markør proteiner med AC confocal mikroskopi for laserskanning. Omvendt, observere uttrykksmønster av en ukjent funksjonelle gen –GFP fusion under embryogenesis kan gi en link mellom embryoet mønstre og uttrykk for det genet og lette identifisering av nye gener som kreves for embryogenesis i Arabidopsis.
Metoden beskrevet her kan også brukes som karakteriserer fenotypen av et embryo-dødelige mutant, og å fastslå effekten av berørte genet på embryogenesis på cellenivå. Videre, i kombinasjon med en sammenligning av uttrykksmønster av markør gener under embryogenesis mellom vill-type og mutant planter, metoden kan gi hint om molekylære mekanismer og signalnettverk trasé involvert i embryogenesis8,9. Faktisk metoden ble brukt naa10 planter, og det ble funnet at unormal delingen av hypofysen i mutant kan skyldes en endring i auxin distribusjonen i embryogenesis5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovule klaring er en nyttig metode for å oppdage celledeling og vurdere morfologi under embryogenesis i Arabidopsis; bruker denne teknikken, kan embryo observeres direkte under DIC mikroskopi5,12. Det kritiske trinnet for ovule klarering er skritt 1.3.4. Tiden som kreves for ovule klarering i trinn 1.3.4 er variabel. Embryo på 2/4-cellers scenen kan observeres klart etter 2 timer på Høyer løsning, mens de ser utydelig etter 12 h. Dermed mer moden en …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Jessica Habashi for kritisk lesing av manuskriptet. Vi takker Dr. Xianyong Sheng Imaging Center, College biovitenskap, hovedstaden Normal University (Beijing, Kina), for å utføre lokaliseringen av DR5-GFP analysen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Beijing Municipal regjeringen Science Foundation (CIT & TCD20150102) og fra National Natural Science Foundation av Kina (31600248).
Materials
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495-555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-ml tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-ml tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment | ||
References
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
- Wendrich, J. R., Weijers, D. The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model. New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).
- ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo. Development. 142 (3), 420-430 (2015).
- Feng, J., et al. Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).
- Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo. Development. 118, 575-587 (1993).
- Luo, Y., et al. D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis. Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).
- Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation. Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).
- Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).
- Friml, J., et al. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).
- Fiume, E., Fletcher, J. C. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).
- Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein. Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).
