Метод для характеризующие эмбриогенеза в проростках Arabidopsis
Summary
Этот протокол описывает метод для наблюдения эмбриогенеза в проростках Arabidopsis через яйцеклетку Распродажа следуют инспекции формирования зародыша шаблон под микроскопом.
Abstract
Учитывая весьма предсказуемый характер их развития, Arabidopsis эмбрионы использовались как модель для изучения морфогенеза растений. Однако ранней стадии завод эмбрионов малы и содержат несколько клеток, что делает их трудно наблюдать и анализировать. Характеризующих формирование шаблон в завод эмбрионов под микроскопом, используя модель организма Arabidopsisздесь описан метод. После очистки свежей яйцеклеток, используя Хойер решение мобильный номер в и морфология эмбрионы могут наблюдаться и стадии их развития могут определяться дифференциальной помехи контрастной микроскопии с помощью 100 X объектив погружения нефти. Кроме того выражение определенных маркер белков, помеченный с зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) для аннотирования Спецификация идентификации клеток во время структурирования эмбриона контролируется Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Таким образом этот метод может использоваться соблюдать модель формирования в зародыши дикого типа растений на клеточном и молекулярном уровнях и охарактеризовать роль конкретных генов в эмбрион патронирования, сравнивая модели формирования в эмбрионы от дикого типа растений и эмбрионов смертоносных мутантов. Таким образом этот метод может использоваться для характеристики эмбриогенеза в проростках Arabidopsis.
Introduction
Эмбриогенез является раннее событие в развитии высших растений. Зрелая эмбриона формы из зиготы через клеточного деления и дифференциации под строгим генетическим контролем1,2. Арабидопсис эмбрионов являются полезной моделью для изучения управления морфогенеза, потому что последовательность клеточных делений во время эмбриогенеза ниже ожидаемых шаблон3,4. Однако эмбрион Arabidopsis , содержащие один в несколько ячеек слишком малы, чтобы быть замечен и проанализированы. Кроме того мутация некоторых генов может вызвать эмбриона летальность5, указывающее ключевую роль этих генов в эмбриогенезе. Характеристика формирования шаблона в зародыш смертоносных мутантов обеспечивает основу для понимания молекулярный механизм, при котором важно генов регулировать развитие эмбриона.
Подробный метод описан здесь для характеристики формирования зародыша шаблон в модели растение Arabidopsis прямого микроскопические наблюдения. Метод предполагает яйцеклетку Распродажа следуют микроскопические наблюдения эмбриона. Характеристика эмбриона смертоносных мутантов также описал.
Морфология эмбрионов на разных этапах своего развития может определяться непосредственно микроскопии, используя яйцеклеток, которые были очищены с Hoyer решение6,7. Такие семяпочек демонстрируют высокий коэффициент преломления; Таким образом этот яйцеклетку, очистка метод особенно выгодно для образцов, которые должны соблюдаться дифференциальной помехи микроскопия контраста (ОПК).
Кроме того гены, которые выражаются в определенной ячейке или ограниченное количество клеток во время эмбриогенеза может использоваться в качестве маркеров для идентификации клетки эмбриона. Таким образом Спецификация идентификации клеток во время эмбриогенеза может быть Аннотированная контролируя экспрессию белков GFP-тегами маркер, используя Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. И наоборот наблюдения выражения неизвестного функциональных генов –GFP фьюжн во время эмбриогенеза может служить связующим звеном между эмбриона кучность и экспрессия этого гена и способствовать выявлению новых генов, которые требуются для эмбриогенеза в арабидопсиса.
Метод, описанный здесь может использоваться также характеризовать фенотип эмбриона смертоносных мутантов и для определения воздействия пострадавших гена на эмбриогенеза на клеточном уровне. Кроме того в сочетании с сравнение выражения шаблона маркерных генов во время эмбриогенеза между растениями дикого типа и мутантов, метод может принести подсказки о молекулярных механизмов и сигнальных путей, участвующих в эмбриогенезе8,9. Действительно этот метод был применен к naa10 растений, и было установлено, что аномальные разделение гипофиза в мутанта может быть вызвано изменением ауксинов распределения во время эмбриогенеза5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Распродажа яйцеклетку является полезным методом для обнаружения деление клеток и оценки морфологии во время эмбриогенеза в арабидопсиса; используя эту технику, эмбрионы можно наблюдать непосредственно под ДВС микроскопии5,12. Важным шагом для офор?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Джессика Хабаши за критически прочтения рукописи. Мы благодарим д-р Xianyong Sheng центра изображения, Колледж наук о жизни, Capital Normal University (Пекин, Китай), для выполнения локализации DR5-GFP assay. Эта работа была поддержана гранты от фонда науки муниципального правительства Пекин (CIT & TCD20150102) и из национального фонда Китая естественных наук (31600248).
Materials
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495-555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-ml tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-ml tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment | ||
References
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
- Wendrich, J. R., Weijers, D. The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model. New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).
- ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo. Development. 142 (3), 420-430 (2015).
- Feng, J., et al. Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).
- Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo. Development. 118, 575-587 (1993).
- Luo, Y., et al. D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis. Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).
- Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation. Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).
- Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).
- Friml, J., et al. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).
- Fiume, E., Fletcher, J. C. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).
- Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein. Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).
