Imaging rod hår morfologi af Arabidopsis stiklinger i en to-lags mikrofluid Platform
Summary
Denne artikel viser, hvordan du kultur Arabidopsis thaliana stiklinger i en to-lags mikrofluid platform, der begrænser de vigtigste rod og rodtråde til et enkelt optisk fly. Denne platform kan bruges til real-time optiske billeddannelse af fine root morfologi såvel som for høj opløsning imaging med andre midler.
Abstract
Rodtråde øge root areal for bedre vand optagelse og næringsstof absorption af anlægget. Fordi de er små i størrelse og ofte skjules af deres naturlige miljø, er rod hår morfologi og funktion svær at studere og ofte udelukket fra planteforskning. I de seneste år, har mikrofluid platforme tilbudt en måde at visualisere rodsystemer med høj opløsning uden at forstyrre rødderne under overførsel til et billedbehandlingssystem. Mikrofluid platform præsenteres her bygger på tidligere plante-on-a-chip forskning ved at indarbejde en to-lags enhed for at begrænse Arabidopsis thaliana hovedrod af samme optiske flyet som root hår. Dette design giver mulighed for kvantificering af rodtråde på en cellulær og organelle plan og også forhindrer z-aksen drivende under tilsætning af eksperimentelle behandlinger. Vi beskriver, hvordan du gemmer enhederne i et indesluttet og hydreret miljø, uden behov for fluidic pumper, samtidig opretholde en kimfri miljø for sætteplante. Efter den optiske billeddannelse eksperiment, kan enheden afmonteret og bruges som substrat for atomic force eller scanning elektronmikroskopi samtidig med fine root strukturer intakt.
Introduction
Fine rod funktioner øger vand og næringsstoffer anskaffelse for anlægget, udforske nye jord rum og øge den samlede rod overflade areal. Omsætningen af disse fine rod funktioner spiller en stor rolle i at stimulere den underjordiske fødevarekæden1 og antallet af fine rødder i visse plantearter er forventede fordobling under forhøjet atmosfærisk kuldioxid2. Fine rødder er generelt defineret som dem, mindre end 2 mm i diameter, selv om nye definitioner fortaler for kendetegner fine rødder af deres funktion3. Ligesom mange fine rødder, rodtråde give funktion af udbredelse og absorption men indtager et meget mindre rum med diametre på rækkefølgen mikron. På grund af deres lille størrelse, rodtråde er vanskelige at billedet i situ og ofte overses som en del af den overordnede rod arkitektur i feltet skala eksperimenter og modeller.
Ex terra rod hår undersøgelser, sådan fra planter dyrket på agar plader, har givet det videnskabelige samfund med værdifulde oplysninger om cellulære vækst og transport4,5. Mens agar plader tillade rodsystemer at være afbildet i ikke-destruktivt og i realtid, tilbyder de ikke høj miljøkontrol for tilsætning af eksperimentelle behandlinger som næringsstoffer, plantehormoner eller bakterier. En spirende løsning til at lette høj opløsning imaging samtidig også giver dynamisk miljøkontrol har været fremkomsten af mikrofluid platforme for anlægget undersøgelser. Disse platforme har aktiveret, ikke-destruktiv vækst og visualisering af flere plantearter for høj overførselshastighed fænotyper6,7,8,9, isolerede kemiske behandlinger 10, force målinger11,12, og tilsætning af mikroorganismer13. Mikrofluid platform designs har fokuseret på brugen af fælles friarealer fluidic lag hvor rødderne kan udbrede, tillader rodtråde til at glide ind og ud af optisk fokus under vækst eller behandling.
Her præsenterer vi en procedure for at udvikle en to-lags mikrofluid platform ved hjælp af foto og soft-litografi metoder, der bygger på tidligere plante-on-a-chip design ved at begrænse sætteplante rodtråde til samme tænkelig plan som de vigtigste rod. Dette gør det muligt for os at spore rod hår udvikling i realtid, med høj opløsning, og hele den eksperimentelle behandlingsproces. Vores dyrkningsbaserede metoder tillade Arabidopsis thaliana frøplanter at være spiret fra frø inden for platformen og kulturperler for op til en uge i en hydreret og sterile miljø, der ikke kræver brug af sprøjten pumpe udstyr. Når den time-lapse imaging eksperiment har indgået, kan platformen præsenteres her åbnes uden at forstyrre de finere root funktionernes position. Dette tillader brug af andre høj opløsning Billeddannende metoder. Her give vi repræsentative resultater for kvantificering og visualisering af rod hår morfologi i denne platform af optiske, scanning elektronmikroskopi (SEM), og atomic force mikroskopi-teknikker (AFM).
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet i denne artikel for at skabe en plante-on-a-chip platform er unik, idet to-lags design begrænser rodtråde til et enkelt tænkelig plan og platformen kan dekonstrueret og bruges som substrat for høj opløsning ikke-optiske billeddannelse . Ved hjælp af høj opløsning ikke-optiske billeddannelse kan give værdifulde oplysninger om plantevæv, der ikke kunne hentes fra optiske billeddannelse alene. For eksempel, kan AFM imaging give kraft målinger for at beregne elasticiteten i root væv under udvikl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette manuskript har været forfattet af UT-Battelle, LLC under Kontraktnr. DE-AC05-00OR22725 med det amerikanske Department of Energy. USA ‘s regering bevarer og udgiveren, ved at acceptere artikel til offentliggørelse, erkender, at de Forenede Staters regering bevarer en ikke-eksklusiv, indbetalte, uigenkaldelig, verdensomspændende licens til at udgive eller reproducere den offentliggjorte form af Dette manuskript, eller tillade andre at gøre det, for USA ‘s regering formål. Department of Energy vil give offentligheden adgang til disse resultater af føderalt sponsoreret forskning i overensstemmelse med DOE aktindsigt Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Dette arbejde blev delvist understøttet af genomisk Science Program, US Department of Energy, Office of Science, biologiske og miljømæssige forskning, som en del af den plante mikrobe grænseflader videnskabelige fokusområde (http://pmi.ornl.gov). Fabrikation af mikrofluid platforme blev udført i Nanofabrication Research Laboratory på Center for Nanophase materialer Sciences, som er en DOE Office of Science bruger Facility. JAA understøttes af en NSF graduate research fellowship DGE-1452154
Materials
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O’Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
- McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
- Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
- Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
- Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
- Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
- Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
- Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
- Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).
