Beeldvorming van de morfologie van het haar van de wortel van Arabidopsis zaailingen in een twee-laag Microfluidic Platform
Summary
Dit artikel laat zien hoe cultuur Arabidopsis thaliana zaailingen in een twee-laag microfluidic platform dat de belangrijkste wortel en root haren op een interne optische vlak beperkt. Dit platform kan worden gebruikt voor real-time optische beeldvorming van fijne wortel morfologie alsook wat betreft hoge resolutie beeldvorming door andere middelen.
Abstract
Root haren verhogen wortel oppervlakte voor betere opname van water en nutriënten-absorptie door de plant. Omdat ze klein in grootte en vaak bedekt zijn door hun natuurlijke omgeving zijn, zijn root haar morfologie en functie moeilijk om te studeren en vaak uitgesloten van het plantenonderzoek. In de afgelopen jaren hebben microfluidic platformen een manier om te visualiseren wortelstelsel op hoge resolutie zonder verstoring van de wortels bij overdracht naar een imaging systeem aangeboden. Het microfluidic platform hier gepresenteerd bouwt op eerdere plant-on-a-chip onderzoek door het opnemen van een twee-laag-apparaat om te beperken van de belangrijkste wortel van Arabidopsis thaliana aan hetzelfde optische vlak als de haren van de root. Dit ontwerp maakt het mogelijk de kwantificering van root haren op een cellulaire en organel niveau en ook voorkomt dat de z-as drijven bij de toevoeging van experimentele behandelingen. We beschrijven hoe bewaart u de apparaten in een staand en gehydrateerd omgeving, zonder de noodzaak voor fluidic pompen, terwijl het handhaven van een milieu van de gnotobiotic voor de zaailing. Na de optische beeldvorming experiment, kan het apparaat worden gedemonteerd en gebruikt als een basismateriaal voor atomaire kracht of scanning elektronen microscopie terwijl fijn wortel structuren intact.
Introduction
Fijne root functies vergroten water en verwerving van de nutriënten voor de plant, verkennen van nieuwe ruimtes van de bodem en het vergroten van de totale wortel oppervlakte De omzet van deze fijne root functies speelt een belangrijke rol bij het stimuleren van de ondergrondse voedselketen1 en het aantal fijne wortels in bepaalde plantensoorten is verwacht te verdubbelen onder verhoogde atmosferische kooldioxide2. Fijne wortels zijn over het algemeen gedefinieerd als kleiner dan 2 mm diameter, hoewel nieuwe definities pleiten voor het karakteriseren van de fijne wortels door hun functie3. Net als vele fijne wortels, root haren voorzien van de functie van de opname- en absorptie maar bezetten een veel kleinere ruimte met een bosdiameter volgorde van micron. Vanwege het kleine formaat, root haren zijn moeilijk te afbeelding in situ en zijn vaak over het hoofd gezien als een onderdeel van de algemene architectuur van de wortel in veld schaal experimenten en modellen.
Ex terra root haar onderzoeken, zoals zaailingen geteeld op agar platen, de wetenschappelijke gemeenschap hebben voorzien van waardevolle informatie over cellulaire groei en vervoer4,5. Terwijl agar platen toestaan wortelstelsel te worden beeld niet-destructieve wijze en in real time, bieden ze geen hoge omgevingscontrole voor de toevoeging van experimentele behandelingen zoals voedingsstoffen, plantenhormonen of bacteriën. Een opkomende oplossing tot het vergemakkelijken van hoge resolutie imaging terwijl de komst van microfluidic platforms voor plant studies ook bieden dynamische omgevingsbeheersing geweest. Deze platforms hebben ingeschakeld, het niet-destructieve groei en visualisatie van verschillende plantensoorten voor hoge throughput fenotypering6,7,8,9, geïsoleerde chemische behandelingen 10,11,,12van de metingen van de kracht en de toevoeging van micro-organismen13. Microfluidic platform ontwerpen hebben gericht op het gebruik van één open ruimte fluidic lagen waarin de wortels verspreiden kunnen, waardoor de haren van de wortel op drift in en uit optische focus tijdens groei of behandeling.
Hier presenteren we een procedure voor de ontwikkeling van een twee-laag microfluidic platform met behulp van foto- en soft-lithografie methoden die op eerdere plant-on-a-chip ontwerpen voortbouwt door het beperken van de zaailing root haren aan hetzelfde imaging vlak als de belangrijkste wortel. Dit kan we bijhouden root haar ontwikkeling in real time met hoge resolutie, en gedurende het proces van experimentele behandeling. Onze kweken methoden toestaan Arabidopsis thaliana zaailingen te worden ontkiemd uit zaad binnen het platform en gekweekte voor tot een week in een gehydrateerd en steriele omgeving, die het gebruik van spuit pomp apparatuur niet vereist. Zodra de time-lapse imaging experiment heeft gesloten, kan het platform die hier gepresenteerd worden geopend zonder verstoring van de positie van de fijnere root functies. Hierdoor is het gebruik van andere hoge resolutie beeldvormende methoden. Hier voorzien wij representatieve resultaten voor de kwantificering en visualisatie van root haar morfologie in dit platform door optische, scanning elektronen microscopie (SEM), en atomic force microscopie technieken (AFM).
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode die is beschreven in dit artikel voor het maken van een plant-on-a-chip-platform is uniek omdat het twee-laag ontwerpen grenzen de haren van de wortel tot een enkel imaging vliegtuig en het platform kan worden gedeconstrueerd en kan worden gebruikt als een basismateriaal voor hoge resolutie niet-optische beeldvorming . Het gebruik van hoge resolutie niet-optische beeldvorming kan bieden waardevolle informatie over de plant weefsel dat niet uit optische beeldvorming alleen kan worden verkregen. AFM imaging bied…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit manuscript heeft geschreven door UT-Battelle, LLC onder Contract nr. DE-AC05-00OR22725 met het Amerikaanse ministerie van energie. De regering van de Verenigde Staten behoudt en de uitgever, door het aanvaarden van het artikel voor publicatie, erkent dat de regering van de Verenigde Staten behoudt een niet-exclusieve, gestorte, onherroepelijke, wereldwijde licentie om te publiceren of te reproduceren van het gepubliceerde formulier van Dit manuscript, of toestaan dat anderen te doen, voor doeleinden van de regering van de Verenigde Staten. Het Department of Energy zal zorgen voor toegang tot deze resultaten van federale overheid gesponsorde onderzoek overeenkomstig het DOE toegang van het publiek Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Genomic Science Program, US Department of Energy, Office of Science, biologische en milieuonderzoek, als onderdeel van de Plant Microbe Interfaces wetenschappelijke focusgebied (http://pmi.ornl.gov). De fabricage van de platforms van microfluidic werd uitgevoerd in de nanofabricage Research Laboratory in het midden voor Nanophase Materials Sciences, die een DOE-Office van wetenschap gebruiker faciliteit is. JAA wordt ondersteund door een NSF graduate research fellowship DGE-1452154
Materials
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O’Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
- McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
- Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
- Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
- Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
- Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
- Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
- Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
- Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).
