La morfologia dei capelli di radice di semenzali di Arabidopsis in una piattaforma di Microfluidic di due-strato di imaging
Summary
In questo articolo viene illustrato come Arabidopsis thaliana semenzali in una piattaforma di due-strato microfluidici che limita la radice principale e peli radicali per un singolo piano ottico della coltura. Questa piattaforma può essere utilizzata per imaging ottico in tempo reale della morfologia di radice bene anche per quanto riguarda imaging ad alta risoluzione con altri mezzi.
Abstract
Peli radicali aumentare la superficie di radice per migliore assorbimento di acqua e assorbimento delle sostanze nutritive dalla pianta. Perché sono di piccole dimensioni e spesso oscurata dal loro ambiente naturale, funzione e morfologia dei capelli di radice sono difficili da studiare e spesso esclusi dalla ricerca sulle piante. Negli ultimi anni, microfluidica piattaforme hanno offerto un modo per visualizzare la radice sistemi ad alta risoluzione senza disturbare le radici durante il trasferimento di un sistema di imaging. La piattaforma microfluidica presentato qui compilazioni su ricerca precedente pianta-on-a-chip incorporando un dispositivo di due-strato per confinare la radice principale di Arabidopsis thaliana allo stesso piano ottico come i capelli di radice. Questo design consente la quantificazione di peli radicali su un cellulare e organello livello e inoltre impedisce l’asse z alla deriva durante l’aggiunta di trattamenti sperimentali. Descriviamo come conservare i dispositivi in un ambiente confinato e idratato, senza la necessità di pompe fluidiche, pur mantenendo un ambiente gnotobiotici per il semenzale. Dopo l’esperimento di imaging ottico, il dispositivo può essere smontato e utilizzato come substrato per forza atomica o microscopia elettronica a scansione pur mantenendo intatta la strutture delle radici fini.
Introduction
Caratteristiche di radice bene aumentano acqua e acquisizione dei nutrienti per la pianta, esplorare nuovi spazi di terreno e aumentando la superficie di radice totale. Il fatturato di queste caratteristiche del bene principale svolge un ruolo importante nello stimolare la catena alimentare della metropolitana1 e il numero di radici fini in alcune specie di piante è previsto a doppia sotto anidride carbonica atmosferica elevata2. Radici fini sono generalmente definite come quelli inferiori a 2 mm di diametro, anche se nuove definizioni di avvocato per la caratterizzazione di radici fini dalla loro funzione3. Come molte radici fini, peli radicali forniscono la funzione di assorbimento e di assorbimento, ma occupano uno spazio molto più piccolo con diametri dell’ordine di micron. A causa delle loro piccole dimensioni, peli radicali sono difficili da immagine in situ e sono spesso trascurati come parte dell’architettura complessiva radice nel campo scala esperimenti e modelli.
Ex terra dei capelli di radice studia, come nel caso di piantine coltivate su piastre di agar, hanno fornito preziose informazioni sulla crescita cellulare e trasporti4,5la comunità scientifica. Mentre piastre di agar consentono sistemi della radice essere imaged in modo non distruttivo e in tempo reale, essi non offrono alta controllo ambientale per l’aggiunta di trattamenti sperimentali come le sostanze nutrienti, ormoni vegetali o batteri. Una soluzione emergente a facilitare la formazione immagine di alta risoluzione mentre anche offrendo dinamico controllo ambientale è stato l’avvento di piattaforme di microfluidica per studi di pianta. Queste piattaforme hanno permesso la crescita distruttiva e la visualizzazione di diverse specie vegetali per throughput elevato phenotyping6,7,8,9, trattamenti chimici isolati 10, vigore misure11,12e l’aggiunta di microrganismi13. Disegni di piattaforma microfluidica si sono concentrati sull’uso di strati fluidico unico ambiente open space in cui le radici possono propagare, permettendo i capelli di radice alla deriva dentro e fuori di messa a fuoco ottica durante la crescita o il trattamento.
Qui presentiamo una procedura per lo sviluppo di una piattaforma di due-strato microfluidici utilizzando foto e metodi soft-Litografia che si basa su disegni di pianta-on-a-chip precedenti di confinare i semenzale di peli radicali allo stesso piano imaging come la radice principale. Questo ci permette di monitorare lo sviluppo dei capelli di radice in tempo reale, ad alta risoluzione e durante tutto il processo di trattamento sperimentale. I nostri metodi di coltura permettono di Arabidopsis thaliana piantine essere germinati dal seme all’interno della piattaforma e colta per fino ad una settimana in un ambiente sterile e idratata che non richiede l’uso di attrezzature pompa siringa. Una volta che l’esperimento di time-lapse imaging ha concluso, la piattaforma qui presentata possa essere aperti senza disturbare la posizione delle funzioni radice più fini. Questo consente l’utilizzo di altri metodi di imaging ad alta risoluzione. Qui forniamo risultati rappresentativi per la quantificazione e la visualizzazione della morfologia dei capelli di radice in questa piattaforma di microscopia ottica, scansione (SEM) e a forza atomica (AFM) di tecniche di microscopia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto in questo articolo per la creazione di una piattaforma di pianta-on-a-chip è unico in quanto i due strati di design confini i capelli di radice di un unico piano di formazione immagine e la piattaforma può essere decostruiti ed usati come substrato per l’imaging non ottici ad alta risoluzione . Usando la formazione immagine non ottici ad alta risoluzione può fornire informazioni preziose su tessuto della pianta che non poteva essere ottenuto da imaging ottico da solo. Ad esempio, formazione immagin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo manoscritto è stato autore di UT-Battelle, LLC sotto contratto no. DE-AC05-00OR22725 con l’US Department of Energy. Mantiene il governo degli Stati Uniti e l’editore, accettando l’articolo per la pubblicazione, riconosce che il governo degli Stati Uniti mantiene una licenza non esclusiva, liberata, irrevocabile, mondiale per pubblicare o riprodurre il modulo pubblicato di Questo manoscritto, o consentire ad altri di farlo, per scopi di governo degli Stati Uniti. Il dipartimento dell’energia fornirà accesso del pubblico a questi risultati di ricerca sponsorizzato dal governo federale conformemente al piano di accesso pubblico DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Questo lavoro è stato supportato in parte dalla genomica Science Program, US Department of Energy, Office of Science, biologiche e ricerca ambientale, nell’ambito dell’impianto microbo interfacce scientifica Focus Area (http://pmi.ornl.gov). La fabbricazione delle piattaforme microfluidiche è stata effettuata nel laboratorio di ricerca di nanofabbricazione al centro per Nanophase Materials Sciences, che è un DOE Office of Science utente Facility. JAA è supportato da una borsa di ricerca laureato NSF DGE-1452154
Materials
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O’Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
- McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
- Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
- Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
- Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
- Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
- Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
- Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
- Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).
