Imaging roten håret morfologi av Arabidopsis frøplanter i en to-lags Microfluidic plattform
Summary
Denne artikkelen viser hvordan du kultur Arabidopsis thaliana planter i en to-lags microfluidic plattform som begrenser det hovedavdeling rot og rot hår til et enkelt optisk plan. Denne plattformen kan brukes ved sanntid optisk avbildning av fine rot morfologi så vel som for høy oppløsning bilder på andre måter.
Abstract
Rot hår øke rot overflate område for bedre vann opptak og næringsstoffer absorpsjon av anlegget. Fordi de er små i størrelse og ofte skjult av naturen, er roten håret morfologi og funksjon vanskelig å studere og ofte utelatt fra planteforskning. De siste årene, har microfluidic plattformer tilbudt en måte å visualisere rotsystem med høy oppløsning uten å forstyrre røttene under overføring til en tenkelig system. Den microfluidic plattformen presenteres her bygger på tidligere anlegget på-chip forskning ved å innlemme en to-lags enhet for å begrense Arabidopsis thaliana viktigste roten til samme optiske plan som root hårene. Denne utformingen gjør kvantifisering av rot hår på en mobilnettet og organelle nivå og også forhindrer z drivende lagt eksperimentelle behandlinger. Beskriver vi hvordan du lagrer enhetene i et inneholdt og hydrert miljø uten behov for fluidic pumper, mens et gnotobiotic miljø for frøplante. Etter optisk tenkelig eksperimentet, kan enheten være demontert og brukt som et medium for atomic force eller skanning elektronmikroskop samtidig fine rot strukturer intakt.
Introduction
Fin rot funksjoner øke vann og næringsstoffer oppkjøp for anlegget, utforske nye jord områder og øker arealet totalt rot. Omsetningen av funksjonene fine rot spiller en stor rolle i å stimulere t næringskjeden1 og fine røtter i visse plantearter er forventet å doble under opphøyet atmosfærisk karbondioksid2. Fin røtter er generelt definert som mindre enn 2 mm i diameter, selv om nye definisjoner talsmann for å karakterisere fine røtter av deres funksjon3. Som mange fine røtter, rot hår gir funksjonen i opptak og absorpsjon, men tar opp mye mindre plass med diameter på mikron. På grunn av sin lille størrelse, rot hår er vanskelig å image i situ og er ofte oversett som en del av den samlede root arkitekturen i feltet skala eksperimenter og modeller.
Ex terra roten håret studier, eksempel fra planter dyrket på agar plater, har gitt det vitenskapelige samfunnet med verdifull informasjon om mobilnettet vekst og transport4,5. Mens agar plater tillater rotsystem til å avbildes ikke-ødeleggende måte og i sanntid, at de ikke gir høy miljøkontroll for tillegg av eksperimentelle behandlinger som næringsstoffer, plantehormoner eller bakterier. En nye løsning å tilrettelegge høyoppløselig imaging mens også affording dynamisk miljøkontroll har vært ankomsten av microfluidic plattformer for plante studier. Disse plattformene har aktivert ikke-destruktiv vekst og visualisering av flere plantearter for høy gjennomstrømning phenotyping6,7,8,9, isolerte kjemiske behandlinger 10, force målinger11,12og tillegg av mikroorganismer13. Microfluidic plattform design fokusert på bruk av én åpen plass fluidic lag der røttene kan videreføres, tillater rot hårene til drift av optisk fokus under vekst eller behandling.
Her presenterer vi en prosedyre for å utvikle en to-lags microfluidic plattform bruke bilde og myk-litografi metoder som bygger på tidligere anlegget på-chip design av confining frøplante rot hårene på samme tenkelig planet som det hovedavdeling rot. Dette kan vi spore rot hår utvikling i sanntid, med høy oppløsning, og gjennom eksperimentell behandlingsprosessen. Våre culturing metoder kan Arabidopsis thaliana planter å være spirer fra frø i plattformen og kultivert for opptil en uke i et hydrert og sterilt miljø som ikke krever bruk av sprøyten pumpe utstyr. Når time-lapse tenkelig eksperimentet er avsluttet kan plattformen presenteres her åpnes uten å forstyrre plasseringen av de finere rot-funksjonene. Dette tillater bruk av andre høy resolution tenkelig metoder. Her gir vi representant resultater for kvantifisering og visualisering av roten håret morfologi i denne plattformen av optisk, skanning elektronmikroskop (SEM) og atomic force mikroskopi teknikker (AFM).
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet i denne artikkelen for å opprette en plante-on-a-chip plattform er unik ved at den to-lags design rammen rot hårene til et enkelt tenkelig fly og plattformen kan dekonstruerte og brukt som et medium for høy oppløsning ikke-optisk tenkelig . Med høy oppløsning ikke-optisk imaging kan gi verdifull informasjon om anlegget vev som ikke kunne hentes fra optisk tenkelig alene. For eksempel kan AFM bildebehandling gi kraft målene for å beregne elastisitet av rot vev under utvikling eller etter en beste…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette manuskriptet er skrevet av UT-Battelle, LLC under Kontraktnr. DE-AC05-00OR22725 med US Department of Energy. USAs regjering beholder og utgiveren, godtar artikkelen for publikasjonen, erkjenner at myndighetene i USA beholder en ikke-eksklusiv, innbetalt, ugjenkallelig, verdensomspennende lisens til å publisere eller reprodusere publisert form av dette manuskriptet, eller tillate andre å gjøre det, for USA regjeringen formål. Department of Energy vil gi publikum tilgang til disse resultatene av føderalt sponset forskning i samsvar med DOE offentlig tilgang Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Dette arbeidet var støttes delvis av genomisk Science Program, US Department of Energy, Office of Science, biologiske og miljøforskning, som en del av anlegget mikrobe grensesnitt vitenskapelige fokusområdet (http://pmi.ornl.gov). Fabrikasjon av microfluidic plattformene ble gjennomført i forskningslaboratoriet Nanofabrication ved Center for Nanophase materialer fag, som er en DOE kontoret av vitenskap bruker anlegget. JAA støttes av en NSF graduate forskningsstipend DGE-1452154
Materials
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O’Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
- McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
- Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
- Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
- Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
- Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
- Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
- Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
- Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).
