A raiz do cabelo morfologia de plântulas de Arabidopsis em uma plataforma Microfluidic de duas camadas de imagem
Summary
Este artigo demonstra como a cultura de plântulas de Arabidopsis thaliana em uma plataforma de dois-camada microfluidic que restringe a raiz principal e cabelos de raiz para um único plano ótico. Esta plataforma pode ser usada para a imagem latente de óptica em tempo real da morfologia da raiz bem bem como quanto à geração de imagens de alta resolução por outros meios.
Abstract
Pelos radiculares aumentam a área de superfície de raiz para melhor absorção de água e absorção de nutrientes pela planta. Porque eles são pequenos em tamanho e muitas vezes obscurecido pelo seu ambiente natural, função e morfologia da raiz do cabelo são difíceis de estudar e muitas vezes excluídos da pesquisa da planta. Nos últimos anos, plataformas microfluidic tem oferecido uma maneira de visualizar os sistemas de raiz em alta resolução sem perturbar as raízes durante a transferência de um sistema de imagem. A plataforma microfluidic aqui apresentados compilações em pesquisas anteriores de planta-em-um-microplaqueta ao incorporar um dispositivo de duas camadas para confinar a raiz principal de Arabidopsis thaliana ao mesmo plano óptico como os pelos da raiz. Este projeto permite a quantificação dos cabelos de raiz em um celular e organela nível e também impede o eixo z à deriva durante a adição de tratamentos experimentais. Descrevemos como armazenar os dispositivos em um ambiente contido e hidratado, sem a necessidade de bombas fluídico, mantendo um ambiente de gnotobiotic para o seedling. Após a experiência de imagem óptica, o dispositivo pode ser desmontado e usado como um substrato para a força atômica ou microscópio eletrônico de varredura, mantendo estruturas bem raiz intacta.
Introduction
Características de bem de raiz aumentar água e aquisição de nutrientes para a planta, explorando novos espaços do solo e aumentar a área da superfície total da raiz. O volume de negócios desses recursos raiz bem desempenha um papel importante em estimular o metro cadeia alimentar1 e o número de raizes finas em determinadas espécies de plantas é esperado dobrar sob elevado de dióxido de carbono atmosférico2. Raizes finas são geralmente definidos como aqueles menores que 2 mm de diâmetro, embora novas definições defendem caracterizando raizes finas por sua função3. Como muitas raizes finas, cabelos de raiz fornecem a função de captação e absorção, mas ocupam um espaço muito menor com diâmetros da ordem de micra. Por causa de seu tamanho pequeno, pelos radiculares são difíceis de imagem em situ e são negligenciados frequentemente como parte da arquitetura geral da raiz em experimentos de campo escala e modelos.
Ex terra raiz cabelo estuda, tal a partir de mudas cultivadas em placas de ágar, forneceram a comunidade científica com informações valiosas sobre o crescimento celular e transporte4,5. Enquanto as placas de ágar permitem sistemas de raiz ser fotografada não-destrutiva e em tempo real, eles não oferecem alta controle ambiental para a adição de tratamentos experimentais como nutrientes, hormonas vegetais ou bactérias. Uma emergente solução para facilitar a alta resolução de imagem, enquanto também proporcionar controle ambiental dinâmico foi o advento das plataformas microfluidic para estudos de planta. Essas plataformas permitiram o crescimento não-destrutivos e visualização de várias espécies de plantas para alto throughput fenotipagem6,7,8,9, tratamentos químicos isolados 10, medições de força11,12e a adição de microorganismos13. Projetos de plataforma microfluidic centraram-se na utilização de camadas fluídico único espaço aberto, no qual as raízes podem propagar, permitindo que os cabelos de raiz à deriva dentro e fora de foco óptico durante o crescimento ou tratamento.
Aqui nós apresentamos um procedimento para o desenvolvimento de uma plataforma de dois-camada microfluidic usando métodos de macio-litografia e foto que baseia-se projetos de planta-em-um-microplaqueta anteriores por confinar os cabelos de raiz de mudas para o mesmo plano de imagem como a raiz principal. Isso nos permite acompanhar o desenvolvimento da raiz do cabelo em tempo real, em alta resolução e durante todo o processo de tratamento experimental. Nossos métodos de cultivo permitem Arabidopsis thaliana mudas a ser germinadas da semente dentro da plataforma e cultivadas por até uma semana em um ambiente estéril e hidratada que não requer o uso de equipamento de bomba de seringa. Uma vez que o lapso de tempo de imagem experimento concluiu, a plataforma apresentada aqui pode ser aberta sem perturbar a posição dos recursos raiz mais finas. Isto permite o uso de outros métodos de imagem de alta resolução. Aqui nós fornecemos resultados representativos para a quantificação e a visualização da morfologia da raiz do cabelo nesta plataforma por microscopia óptica, varredura (SEM) e de força atômica (AFM) de técnicas de microscopia.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito neste artigo para a criação de uma plataforma de planta-em-um-microplaqueta é o único que da dois-camada design limites os cabelos de raiz para um único plano de imagem e a plataforma pode ser desconstruídos e usados como um substrato para a imagem latente não-ópticos de alta resolução . Usando a imagem latente não-ópticos de alta resolução pode fornecer informações valiosas sobre o tecido de planta que não pode ser obtido da optical imaging em paz. Por exemplo, imagens de AFM podem fo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este manuscrito foi criado pela UT-Battelle, LLC sob contrato n º DE-AC05-00OR22725 com o departamento de energia dos EUA. O governo dos Estados Unidos mantém e Publicador, aceitando o artigo para publicação, reconhece que o governo dos Estados Unidos mantém uma licença não-exclusiva, integralizada, irrevogável, mundial, para publicar ou reproduzir o formulário publicado de Este manuscrito, ou permitir que outros o façam, para fins de governo dos Estados Unidos. O departamento de energia irá fornecer o acesso do público a esses resultados de pesquisa patrocinado pelo governo federal, em conformidade com o plano de acesso público DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Este trabalho foi financiado em parte pelo programa de ciência genômica, departamento de energia dos EUA, escritório de ciência, biológico e investigação ambiental, como parte da planta micróbio Interfaces foco área científica (http://pmi.ornl.gov). A fabricação das plataformas microfluidic foi realizada no laboratório de pesquisa de nanofabricação no centro para Nanophase Ciências dos materiais, que é uma facilidade do DOE escritório de ciência usuário. JAA é apoiada por uma bolsa de pós-graduação pesquisa de NSF DGE-1452154
Materials
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
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