Imaging rotahåret morfologi av Arabidopsis plantor i en två-lagers mikroflödessystem plattform
Summary
Denna artikel visar hur kultur Arabidopsis thaliana plantor i en två-lagers mikroflödessystem plattform som begränsar den viktigaste roten och rothår till ett enda optiska plan. Denna plattform kan användas för realtid optisk avbildning av fina rot morfologi samt när det gäller högupplösta imaging med andra medel.
Abstract
Rothår öka rot yta för bättre vatten upptag och näringsämne absorption av anläggningen. Eftersom de är små i storlek och ofta skyms av deras naturliga miljö, är rotahåret morfologi och funktion svåra att studera och ofta utestängda från växtforskning. Under de senaste åren har mikroflödessystem plattformar erbjudit ett sätt att visualisera rotsystem med hög upplösning utan att störa rötterna under överföringen till en bildsystem. Mikroflödessystem plattformen presenteras här bygger på tidigare växt-på-ett-chip forskning genom att införliva en två-lagers enhet om du vill begränsa Arabidopsis thaliana huvudsakliga roten till samma optiska plan som rothår. Denna konstruktion möjliggör kvantifiering av rothår på en cellulär och organell nivå och även förhindrar z-axis drifting under tillägg av experimentella behandlingar. Vi beskriver hur du lagrar enheterna i en innesluten och återfuktad miljö, utan behovet av fluidic pumpar, samtidigt som en gnobiotisk miljö för plantan. Efter optisk imaging experimentet, kan enheten demonteras och används som ett substrat för atomic force eller svepelektronmikroskopi samtidigt hålla fina rot strukturer intakta.
Introduction
Fina rot funktioner ökar vatten och näringsämnen förvärv för anläggningen, att utforska ny mark blanksteg och öka den totala rot yta. Omsättningen för dessa fina rot funktioner spelar en viktig roll för att stimulera den underjordiska livsmedelskedjan1 och antalet fina rötter i vissa växtarter är beräknade att fördubblas under förhöjda koldioxidhalten i atmosfären2. Boten rotar generellt definieras som de mindre än 2 mm i diameter, även om nya definitioner förespråka kännetecknar Boten rotar av deras funktion3. Liksom många fina rötter rothår ger funktion upptag och absorption men tar upp mycket mindre plats med diametrar på order av µm. På grund av sin storlek, rothår svårt att bilden i situ och förbises ofta som en del av den övergripande arkitekturen för root i fältet skala experiment och modeller.
Ex terra rotahåret studier, exempelvis plantor odlas på agarplattor, har det vetenskapliga samfundet med värdefull information om celltillväxt och transport4,5. Agarplattor tillåta rotsystem att avbildas icke-förstörande och i realtid, erbjuder de inte hög miljökontroll för tillägg av experimentella behandlingar som näringsämnen, växt hormoner eller bakterier. En framväxande lösning för att underlätta hög upplösning imaging också ger dynamiska miljökontroll varit tillkomsten av mikrofabricerade plattformar för växt studier. Dessa plattformar har aktiverat oförstörande tillväxt och visualisering av flera växtarter för hög genomströmning fenotypning6,7,8,9, isolerade kemiska behandlingar 10, kraft mätningar11,12och tillägg av mikroorganismer13. Mikroflödessystem plattform mönster har fokuserat på användningen av enda öppet utrymme fluidic lager där rötterna får propagera, tillåter de rothår glida in och ut ur optisk fokus under tillväxt eller behandling.
Här presenterar vi ett förfarande för att utveckla en två-lagers mikroflödessystem plattform med foto och soft-litografi metoder som bygger på tidigare växt-på-ett-chip mönster genom inskränker de plantan rothår till samma imaging plan som huvudsakliga roten. Detta tillåter oss att spåra rotahåret utveckling i realtid, med hög upplösning, och hela processen experimentell behandling. Våra culturing metoder Tillåt Arabidopsis thaliana plantor att vara grodda från frö inom plattformen och odlade för upp till en vecka i en återfuktad och steril miljö som inte kräver användning av sprutan pumputrustning. När time-lapse imaging experimentet har ingått, kan den plattform som presenteras här öppnas utan att störa de finare rot-funktionerna position. Detta tillåter användning av andra högupplösta avbildningsmetoder. Här tillhandahåller vi representativa resultat för kvantifiering och visualisering av rotahåret morfologi i denna plattform av optisk, scanning electron microscopy (SEM), och atomic force microscopy tekniker (AFM).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som beskrivs i denna artikel för att skapa en plattform för växt-på-ett-chip är unik genom att den två-lagers utforma ramarna rothår till en enda bildplanen och plattform kan dekonstrueras och användas som substrat för högupplösta icke-optisk imaging . Med hjälp av högupplösta icke-optisk imaging kan ge värdefull information om den växtvävnad som inte kunde erhållas från optisk imaging ensam. AFM imaging kan exempelvis ge kraft mätningar för att beräkna elasticiteten i roten vävnader unde…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta manuskript har skrivits UT-Battelle, LLC under Kontraktsnr DE-AC05-00OR22725 med US Department of Energy. Förenta staternas regering behåller och förlaget, genom att godkänna artikeln för publicering, erkänner att Förenta staternas regering behåller en icke-exklusiv, inbetalda, oåterkallelig, världsomfattande licens att publicera eller reproducera det publicerade formuläret för Detta manuskript, eller tillåta andra att göra det, för Förenta staternas regering ändamål. Department of Energy kommer att ge allmänheten tillgång till dessa resultat av federalt sponsrade forskning i enlighet med DOE allmänhetens tillgång planen (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Detta arbete stöds delvis av den genomiska Science Program, US Department of Energy, Office of Science, biologiska och miljöforskning, som en del av anläggningen mikrob gränssnitt vetenskapliga fokusområdet (http://pmi.ornl.gov). Tillverkning av mikrofabricerade plattformarna genomfördes i Nanotekniklaboratoriet forskning vid centrum för Nanophase materialvetenskaper, som är en DOE Office av vetenskap användaren anläggning. JAA stöds av en NSF graduate research fellowship DGE-1452154
Materials
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O’Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
- McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
- Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
- Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
- Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
- Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
- Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
- Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
- Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).
