Determinación de la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas en cultivos de astrocitos primarios usando biotinilación
Summary
En este informe se presentan dos métodos basados en la biotinilación, diseñados para determinar la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas expresadas en la membrana plasmática.
Abstract
Las proteínas de la superficie celular median una amplia gama de funciones. En muchos casos, su actividad está regulada por procesos endocíticos que modulan sus niveles en la membrana plasmática. Aquí, presentamos protocolos detallados para 2 métodos que facilitan el estudio de estos procesos, los cuales se basan en el principio de la biotinilación de las proteínas de la superficie celular. El primero está diseñado para permitir la determinación semi-cuantitativa de los niveles relativos de una proteína particular en la superficie celular. En él, los residuos de lisina de las proteínas de membrana plasmática de células se marcan primero con un resto de biotina. Una vez que las células se lisan, estas proteínas pueden ser precipitadas específicamente mediante el uso de estreptavidina inmovilizada con agarosa explotando la afinidad natural de ésta con la biotina. Las proteínas aisladas de tal manera pueden analizarse a continuación mediante un procedimiento de transferencia Western estándar. El segundo método proporciona un medio para determinar la velocidad endocítica de una partículaAr de la superficie celular durante un período de tiempo. Las proteínas de la superficie celular se modifican primero con un derivado de biotina que contiene un enlace disulfuro escindible. Las células se desplazan de nuevo a condiciones normales de cultivo, lo que provoca la captación endocítica de una proporción de proteínas biotiniladas. A continuación, los enlaces disulfuro de los grupos de biotina no internalizados se reducen usando el agente reductor impermeable a la membrana glutatión. A través de este enfoque, las proteínas endocitadas pueden aislarse y cuantificarse con un alto grado de especificidad.
Introduction
Las proteínas en la superficie celular desempeñan una variedad de funciones centrales para mantener la función celular. En numerosos casos, su actividad depende o modulada por procesos endocíticos que los secuestran temporalmente en sitios intracelulares o que los dirigen hacia vías de degradación 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Aquí, destacamos dos enfoques basados en la biotinilación diseñados para permitir al usuario identificar y aislar específicamente proteínas expresadas en la membrana plasmática, y las nuevas internalizadas. A través de estos métodos, se puede cuantificar la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de cualquier proteína de interés, permitiendo así una evaluación más clara de su regulación.
Determinación de la expresión relativa de la proteína de la superficie celular por biotinilación
La biotina, o vitamina B7, anteriormente conocida como vitamina H 6 , es una pequeña molécula soluble en agua que puede usarse para modificar químicamente grupos reactivos de amina, sulfhidrilo y carboxilo de moléculas biológicas. El cultivo actual de reactivos de biotinilación de la superficie celular consiste principalmente en ésteres de N-hidroxisuccinimida (sulfo-NHS) sulfonados y impermeables a la membrana de biotina o sus derivados, diseñados para reaccionar con las aminas presentes en las cadenas laterales de residuos de lisina de proteínas expresadas en La superficie celular cuando éstas se desprotonan en condiciones básicas, dando como resultado que este último forme un enlace amida con el resto biotina 7 . Las proteínas de la superficie celular modificadas de este modo pueden aislarse a continuación mediante el uso de avidina, una proteína tetramérica de 66 – 69 kDa que posee una gran afinidad por la biotina, uniéndose a ésta con una constante de disociación de aproximadamente 10-15 , marcándola como una de las Las interacciones no covalentes más fuertes conocidas 8 </suP> , 9 .
En estudios previos se han utilizado varios métodos alternativos para cuantificar la expresión de proteínas en la superficie celular. El etiquetado de células no permeabilizadas usando anticuerpos marcados fluorescentemente específicos para la proteína de interés, seguido por visualización a través de microscopía de fluorescencia, por ejemplo, es un enfoque comúnmente empleado, pero depende en gran medida de la disponibilidad de anticuerpos que pueden unirse a epítopos extracelulares. Más recientemente, también se han empleado con éxito métodos que implican el uso de proteínas quiméricas que portan fluoróforos sensibles al pH que reaccionan a estar expuestos a medios ácidos. Sin embargo, tales ensayos implican usualmente la expresión exógena de estas construcciones en líneas celulares en las que la proteína de interés no se encuentra de forma nativa. Estos enfoques son, no obstante, capaces de proporcionar información valiosa sobre la localización subcelular y el itinerario exocítico de laY por lo tanto deben usarse conjuntamente con los enfoques basados en la biotinilación descritos aquí si las herramientas están disponibles.
En un ensayo de biotinilación típico, las células se lavan primeramente a fondo en PBS a 4ºC. Esto elimina cualquier traza de proteínas de suero introducidas por el medio de cultivo, asegurando así que éstas no consumirán cantidades en exceso de biotina en la siguiente etapa. Más importante aún, la reducción de la temperatura hace que la endocitosis desacelere significativamente. A continuación se añade el reactivo de biotinilación. A continuación, se lavan de nuevo las células y después se incuban con un tampón de enfriamiento que contiene glicina o NH4Cl, cuyo propósito es inactivar todas las trazas restantes de biotina sin reaccionar. A continuación se lisan las células, tras lo cual se agrega estreptavidina inmovilizada con agarosa para precipitar las proteínas biotiniladas. El análisis se realiza comúnmente mediante Western Blot, lo que permite la relativa expresión de la superficie celular de diversos prOteins a ser cuantificados.
Debido a la base de este ensayo, es adecuado para su uso sólo con proteínas que poseen porciones expuestas al medio extracelular. Las proteínas transmembrana multipaso, que poseen probablemente un número de lisinas reactivas dentro de sus regiones de bucle, son las más susceptibles a este método, mientras que las proteínas de una sola pasada tienden a ser menos susceptibles a ser biotiniladas. Incluso en estos casos, existe la posibilidad de que los cambios conformacionales o las interacciones intermoleculares puedan ocluir ciertos sitios reactivos, dando como resultado un rendimiento de biotinilación inferior al esperado.
Determinación de la tasa de internalización de las proteínas de la superficie celular por biotinilación
Los principios de este ensayo son en gran parte similares a los de la biotinilación de la superficie celular, con un número de excepciones, el más importante de los cuales es el uso de reactivos de biotinilación reversibles. Los grupos de biotina (de estos) poseen disuLos enlaces fijos, dentro de sus estructuras, que son susceptibles a agentes reductores; Esto se explota para garantizar que sólo las proteínas de la superficie celular tomadas en sitios intracelulares durante el período de ensayo se dejará biotinilado. Un ensayo generalmente tiene lugar de la siguiente manera. Primero se lavan las células y se biotinilan con reactivos fríos, después se reintroduce el medio de cultivo celular a 37 ° C y las células se devuelven a la incubadora; Esto hace que las proteínas de la superficie celular marcadas se sometan a endocitosis. El agente reductor glutatión – que no puede penetrar en la membrana – se añade entonces para romper los enlaces disulfuro de los restos de biotina unidos a proteínas que permanecen en la superficie celular. Finalmente, los enlaces disulfuro rotos se hacen reaccionar con yodoacetamida, consumiendo los grupos tiol lábil e impidiendo que los enlaces se reformen. Como antes, las células se lisan a continuación, y las proteínas marcadas se precipitan usando estreptavidina-agarosa.
El disco de limitacionesUssed en la sección anterior también se aplican aquí debido a las similitudes compartidas entre los métodos. Además, vale la pena tener en cuenta que los cambios de temperatura implicados en este ensayo impiden la determinación exacta de la cantidad de proteína que se endocitosa para cada incremento de tiempo, particularmente en el caso de proteínas rápidamente internalizadas o que reciclan rápidamente. Por lo tanto, el ensayo sólo proporciona una estimación semicuantitativa de las tasas endocíticas. La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total puede usarse para rastrear la absorción de cada vesícula cargada y proporcionar una medición más precisa de la cinética de la endocitosis. Por lo tanto, puede proporcionar un complemento muy útil para este ensayo, suponiendo que una construcción quimérica etiquetada con fluorescencia de la proteína de interés está disponible [ 11] .
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificaciones:
Como estos métodos fueron diseñados para su uso con células adherentes, hemos especificado el uso de PBS que contiene 100 mg / L de MgCl2 ∙ 6H 2 O y
100 mg / L de CaCl2 (CM-PBS) para las etapas de lavado y como la base de ciertos tampones para asegurar que las células permanecen unidas a la superficie de cultivo y que las uniones célula-célula no se interrumpen. Sin embargo, los protocolos también se pueden aplicar a tipos de célul…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud PG # 20R47867.
Materials
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal bovine serum | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
