3D Microtissues for injiserbare regenerativ Therapy og høy gjennomstrømming narkotikarelaterte Screening

Summary

Denne protokollen beskriver fabrikasjon av elastisk 3D macroporous microcryogels ved å integrere microfabrication med cryogelation teknologi. 3D microtissues genereres ved lasting med celler, som kan være lett injisert i vivo å lette regenerativ therapy eller samlet inn matriser for i vitro høy gjennomstrømming narkotikarelaterte screening.

Abstract

Du kan oppgradere tradisjonelle 2D cellekultur til 3D cellekultur, har vi integrert microfabrication med cryogelation teknologi for å produsere macroporous Mikroskala cryogels (microcryogels), som kan lastes inn med en rekke celletyper til 3D microtissues. Her presenterer vi protokollen for å dikte allsidig 3D microtissues og deres programmer i regenerativ therapy og narkotikarelaterte screening. Størrelse og form kontrollerbare microcryogels kan være laget på en rekke chip, som kan være høstet av prosessoren som individuelle celle-lastet bærer for injiserbare regenerativ therapy eller bli ytterligere montert på prosessoren til 3D microtissue matriser for høy gjennomstrømming narkotikarelaterte screening. På grunn av høy elastisk natur disse Mikroskala cryogels utstilling av 3D microtissues stor injectability for minimal invasiv cellen terapi ved å beskytte celler fra mekanisk skjær force under injeksjon. Dette sikrer forbedret celle overlevelse og terapeutisk effekt i musen lem iskemi modellen. I mellomtiden forenkler montering av 3D microtissue matriser i standardformat 384-multi-godt bruken av felles laboratoriefasiliteter og utstyr, slik at høy gjennomstrømming narkotikarelaterte screening på denne allsidige 3D celle kultur plattformen.

Introduction

Tradisjonelle cellekultur på flat todimensjonal (2D) flater, som en kultur parabol eller flere bra plater, kan knapt framprovosere celle atferd nær innfødt stater. Nøyaktig recapitulation av innfødte mobilnettet microenvironments, som består av ulike celletyper, ekstracellulære matriser og bioaktive løselig faktorer i tredimensjonale (3D) arkitekturer^{1,2,3 ,4}, er avgjørende for å konstruere biomimicking vev i vitro for programmer i vev engineering, regenerativ medisin, grunnleggende biologi forskning og drug discovery^{5,6,7 ,8,9}.

I stedet for 2D cellekultur, 3D cellekultur er mye brukt til å fremme biomimetic mikro-arkitektur og funksjonelle egenskaper celleområde kultivert i vitro. En populær 3D celle kultur metode er å samle celler i spheroids^7,8,9,10. Mobilnettet spheroids kan injiseres skadet vev med forbedret mobilnettet oppbevaring og overlevelse i forhold til injeksjon av spredte celler. Imidlertid føre ikke-uniform spheroid størrelser og uunngåelig mekanisk skade pålagt celler med flytende skjær makt under injeksjon til dårlig celle terapeutiske effekter^11,12,13. På samme måte, den iboende ingen-enhetlighet under samling av spheroids har gjort sin oversettelse til 3D cellebasert høy gjennomstrømming narkotikarelaterte screening utfordrende¹⁰.

En annen metode for 3D cellekultur oppnås med hjelp av biologisk materiale, som vanligvis omslutter celler i vandig hydrogels eller porøse stillaser. Det gir større flexibilities bygger 3D arkitekturer. For terapi leveres celler innkapslet i bulk stillaser vanligvis til dyr kroppen via kirurgisk implantasjon, invasiv og traumatisk, derfor begrense sin brede oversettelse til sengen. På den annen side, aktivere vandig hydrogels minimal invasiv behandling ved å injisere cellene suspendert i hydrogel forløper løsning i dyr organer, slik at i situ gelation via thermo-kjemisk eller enzymatisk crosslinking¹¹. Men som cellene leveres mens hydrogel forløpere er fortsatt i vandig tilstand, er de også utsatt for mekaniske skjær under injeksjon. Ikke bare det, kjemiske eller enzymatisk crosslinking under i situ gelation av hydrogel kan også innføre skade celler innenfor. For narkotikarelaterte screening møter biomateriale-assistert cellekulturer problemer med ensartethet, kontrollerbarhet og gjennomstrømning. Bruker hydrogels, er cellene vanligvis involvert under gelation, som prosessen kan påvirke celle levedyktighet og funksjon. Gelation under cellen seeding hemmer også bruk av de fleste høy gjennomstrømming utstyr, siden hydrogel må holdes på is for å hindre gelation før cellen frø, og hydrogel kan jam dispensering tips, som er vanligvis svært tynn å sikre nøyaktighet for høy gjennomstrømming screening. Pre-formet stillaser kan potensielt skille biomateriale fabrikasjon prosedyrer fra cellekultur, men de fleste stillaset-baserte produkter er tilgjengelig som bulkgods med relativt lavere produksjon¹⁴.

For å overvinne noen av svakhetene ved dagens 3D kultur metoder, har vi utviklet en microfabrication-cryogelation integrert teknologi å utvikle en sokkel og brukervennlig microcryogel matrise chip¹⁵. I denne protokollen valgt gelatin formidle microcryogel fabrikasjon teknikk som det er biokompatible, nedbrytbare og kostnadseffektiv, og ingen ytterligere endringer er nødvendig for cellen vedlegg. Andre polymerer av naturlig eller syntetisk kilder kan også brukes for fabrikasjon, avhengig av programmet. Via denne teknologien, kan vi utvikle miniatyriserte og svært elastisk microcryogels med kontrollerbar størrelse, form og oppsett. Når lastet med en rekke celletyper, kan 3D microtissues genereres for forskjellige søknadene. Disse unike funksjoner aktiverer ønsket injectability, cellebeskyttelse og nettsted rettet oppbevaring etter injeksjon i vivo for forbedret terapeutiske effekter. Ikke bare det, microcryogels kan bearbeides videre for å danne 3D microtissue matriser som er kompatible med vanlige laboratorieutstyr og instrumenter å realisere høy gjennomstrømming cellekultur for allsidig narkotikarelaterte screening og andre cellulære analyser. Her, skal vi detalj fabrikasjon prosessen med microcryogels og dens etter behandling som individuelle 3D microtissues eller 3D microtissue matriser for to viktige programmer, cellen terapi og narkotikarelaterte screening, henholdsvis^10,15 .

Protocol

dyreforsøk fulgte streng protokoll godkjent av dyr etikk på senter for biomedisinsk analyse, Tsinghuauniversitetet. Under godkjenning av komité for etikk, menneskelige fettvev ble Hentet fra Institutt for Plastic Surgery Peking Union sykehus med samtykke fra pasienter. 1. fabrikasjon av 3D Microcryogels Design and fabrikasjon av microstencil matrise chips Bruk en kommersiell programvare til design matriser av bestemte geometri, for eksempel sirkler, elli…

Representative Results

Fabrikasjon og karakterisering av microcryogels for 3D microtissue-formasjonen. Ifølge denne protokollen, microcryogels ble laget skjemaet 3D microtissues og individuelle microcryogels eller microcryogel matriser, og ble brukt til regenerativ therapy og narkotikarelaterte screening, henholdsvis (figur 1). Microstencil matrise chips fabrikkert fra PMMA ble brukt som micromolds for m…

Discussion

Regenerativ medisin og i vitro modeller for narkotikarelaterte screening er to viktige programmer for tissue engineering^5,6,7,8,9. Disse to programmene har svært ulike behov, ligger en felles mellom dem i behovet for en mer biomimetic dyrking tilstand å forbedre celle funksjoner¹⁹. Bare med forbedret celle funksjoner i forskn…

Materials

Gelatin	sigma	G7041	All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.
Glutaraldehyde	J&K	902042	Used as crosslinker in preparation of material.
Glass cover slip (24X50mm)	CITOGLASS, China	10212450C	To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.
Sodium borohydride, NaBH4	Beijing Chemical Works	116-8	To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.
Vacuum jar	asperts, China	VC8130	To preserve microgels under vacuum.
Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets	Sunjin Electronics Co., Ltd, China		Ordinary PMMA sheets.
Rayjet laser system	Rayjet, Australia	Rayjet 50 C30	To engrave PMMA sheets to form wells.
Plasma Cleaner	Mycro Technologies, USA	PDC-32G	To make PMMA hyphophilic.
Lyophilizer	Boyikang, China	SC21CL	To lyophilize materials.
Trypan Blue solution (0.4%)	Zhongkekeao, China	DA0065	To dye microgels.
Doxorubicin hydrochloride	ENERGY CHEMICAL, China	A01E0801360010	To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.
Live/dead assay	Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan)	CS01-10	To distinguish alive and dead cells.
Cell Titer-Blue	Promega (Wisconsin, USA).	G8080	To test cell viability.
Cell strainer	BD Biosciences, USA	352360	To collect microgels.
D-Luciferin	SYNCHEM (Germany)	s039	To tack cells.
Scanning electron microscope	FEI, USA	Quanta 200	To characterize microgel morphology.
Mechanical testing machine	Bose, USA	3230	To measure mechanical features.
Programmable syringe pump	World Precision Instruments, USA	ALADINI 1000	To test injactabiliy.
Digital force gauge	HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China	H-50	To test injactabiliy.
Ethylene oxide sterilization system	Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC	AN74i	To sterilize microgels with ethylene oxide gas.
Microplate reader	Molecular Devices,USA	M5	To measure fluorescence intensity in micro-array.
Confocal microscope	Nikon, Japan	A1Rsi	To observe cell distribution in 3D.
Xenogen  Lumina II imaging system	Caliper Life Sciences, USA	IVIS	To track cell in animals.
Liquid work stataion	Apricot design,USA	S-pipette	To load medium or cell suspension high-throuputly.