JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bio-ingénierie

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

Published: October 04, 2017
doi:
10.3791/55982
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine,Tsinghua University, 2Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, 3School of Life Sciences,Tsinghua University

Summary

Bu iletişim kuralı elastik 3D macroporous microcryogels imalatı microfabrication cryogelation teknolojisi ile entegre ederek açıklar. Hücrelerle yükleme üzerine, 3D microtissues, hangi rejeneratif terapi kolaylaştırmak için kolayca enjekte içinde vivo olabilir veya diziler vitro yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için içine monte oluşturulur.

Abstract

Geleneksel 2D hücre kültürü 3D hücre kültürü için yükseltmek için biz microfabrication macroporous microscale cryogels (microcryogels), 3D microtissues oluşturmak için hücre tipleri çeşitli ile yüklenen üretmek için cryogelation teknolojisi ile entegre etmiş. Burada, biz çok yönlü 3D microtissues ve rejeneratif terapi ve ilaç tarama uygulamaları imal etmek protokol mevcut. Boyut ve şekil kontrol edilebilir microcryogels hasat çip dışı enjekte edilebilir rejeneratif tedavi için tek tek hücre yüklü taşıyıcıları olarak veya daha fazla monte üstünde-küçük parça içine 3D microtissue diziler yüksek üretilen iş için olmak bir dizi yonga üzerinde fabrikasyon uyuşturucu tarama. Bu microscale cryogels yüksek elastik yapısı nedeniyle, 3D microtissues minimal invaziv hücre tedavisi için büyük injectability enjeksiyon sırasında mekanik kesme kuvvetlerinden hücreleri koruyarak sergi. Bu gelişmiş hücre hayatta kalma ve fare uzuv iskemi modelinde tedavi etkisi sağlar. Bu arada, derleme bir standart 384-multi-iyi biçimde 3D microtissue dizilerin ortak laboratuvar olanakları ve donanımları, yüksek-den geçerek uyuşturucu bu çok yönlü 3D hücre kültür platformda eleme etkinleştirme kolaylaştırır.

Introduction

Yüzeylerde düzleştirilmiş iki boyutlu (2B), bir kültür yemek veya çok iyi Kaplamalar, gibi geleneksel hücre kültürü pek hücre davranışları onların yerli Birleşik yakın temin. Çeşitli hücre tipleri, hücre dışı Matrisler ve biyoaktif çözünür faktörler üç boyutlu (3D) mimarileri1,2,3 oluşturan yerel hücresel microenvironments doğru tekrarlama ,4, biomimicking doku vitro doku Mühendisliği, rejeneratif tıp uygulamalarında oluşturmak için gerekli temel Biyoloji Araştırma ve ilaç keşif5,6,7 ,8,9.

2D hücre kültürü, yerine 3D hücre kültürü biomimetic mikro mimari ilerlemek için yaygın olarak kullanılan ve işlevsel özellikleri hücre vitrokültürlü. Bir popüler 3D hücre kültür toplama pulcuklarının7,8,9,10hücrelere yapılandırmaktır. Hücresel pulcuklarının yaralı dokulara gelişmiş hücresel saklama ve hayatta kalma ile karşılaştırıldığında enjeksiyon dağınık hücrelerinin enjekte. Ancak, üniform olmayan küresel boyut ve hücre enjeksiyon sırasında sıvı kesme zorla dayatılan kaçınılmaz mekanik yaralanma kötü hücre tedavi edici etkileri11,12,13için neden. Benzer şekilde, doğal olmayan-tekdüzelik pulcuklarının toplama sırasında zorlu10eleme 3D hücre tabanlı yüksek üretilen iş uyuşturucu onların çeviri yaptı.

3D hücre kültürü için başka bir yöntem genellikle sulu hydrogels veya gözenekli iskele hücreler kapsüller Biyomalzeme, yardımı ile elde edilir. 3D mimarileri oluşturarak büyük esneklikleri izin veren bir yayın. Terapi için toplu iskele içinde kapsüllü hücreleri genellikle hayvan vücudu invaziv ve travmatik, bu nedenle geniş kendi çeviri başucu için kısıtlama cerrahi implantasyon yoluyla teslim edilir. Öte yandan, sulu hydrogels hayvan cesetleri, situ jelleşme üzerinden termo-, kimyasal veya enzimatik crosslinking11izin içine hidrojel habercisi çözümde askıya hücreleri enjekte edilerek minimal invaziv tedavi etkinleştirin. Whilst hidrojel öncüleri hala sulu bir durumda hücreleri teslim gibi Ancak, onlar da mekanik makas için enjeksiyon sırasında maruz kalır. Sadece öyle değil, kimyasal veya enzimatik crosslinking hidrojel in situ jelleşme sırasında da içindeki hücreleri hasar empoze olabilir. Uyuşturucu tarama için biomaterial destekli hücre kültürleri tekdüzelik, kontrol edilebilirlik ve işlem hacmi ile sorunlarla karşı karşıya. Hydrogels kullanarak, hücreleri genellikle sırasında jelleşme, hangi hücre canlılığı ve işlev süreci etkileyebilir katılmaktadırlar. Hücre tohum sırasında jelleşme Ayrıca kullanımı en yüksek üretilen iş ekipmanı tarafından hidrojel jelleşme tohum hücre önce önlemek için buz üstünde tutulması gereken ve hidrojel için doğruluğunu sağlamak için genellikle çok ince losyonlu ipuçları jam beri engellemektedir yüksek işlem hacmi tarama. Önceden biçimlendirilmiş iskele potansiyel olarak hücre kültürü, biomaterial imalat işlemleri ancak çoğu iskele bazlı ürünler elde edilebilir aynı derecede hacim materyalleri ile nispeten daha düşük işlem hacmi14ayrı.

Bazı geçerli 3D kültür yöntemleri eksikliklerin üstesinden gelmek için bir kapalı ve kullanıcı-dostça microcryogel dizi çip15imal etmek bir microfabrication-cryogelation entegre teknoloji geliştirdi. Bu protokol için jelatin Biyouyumlu, parçalanabilir, düşük maliyetli, ve daha fazla değişiklik hücre eki için gereklidir gibi microcryogel imalat tekniği örneklemek için seçilir. Doğal veya sentetik kaynaklarının diğer polimerler için imalat, uygulamaya bağlı olarak da kullanılabilir. Bu teknoloji ile kontrol edilebilir boyut, şekil ve düzen ile minyatür ve yüksek derecede elastik microcryogels imal. Çeşitli hücre türleri ile yüklendiğinde, 3D microtissues çeşitli uygulamalar için oluşmuş. Bu benzersiz özellikler sonra enjeksiyon vivo içinde Gelişmiş tedavi edici etkileri için istenen injectability, hücre koruması ve site yönettiği saklama sağlar. Sadece öyle değil, microcryogels daha fazla ortak labaratuar donanımları ve yüksek üretilen iş hücre kültürü çok yönlü uyuşturucu tarama ve diğer hücresel deneyleri için gerçekleştirmek için aletleri ile uyumlu 3D microtissue dizileri oluşturmak için işleme. Burada, microcryogels ve tedavi sonrası kendi bireysel 3D microtissues veya 3D microtissue diziler için iki önemli uygulamaları, hücre tedavisi ve uyuşturucu taraması, sırasıyla10,15 olarak imalat süreci ayrıntılı .

Protocol

hayvan deneyleri takip sıkı protokol hayvan Etik Komitesi üzerinde merkezi Biyomedikal analizi, Tsinghua Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Etik Kurulu onayı altında insan yağ dokusu, bölümü, plastik cerrahi, Pekin Birliği hastaneden ile aydınlatılmış onam hastalardan elde edildi. 1. fabrikasyon 3D Microcryogels Tasarım ve imalat microstencil dizi fiş Kullanım ticari yazılım tasarım diziler daire gibi belirli geometrileri için …

Representative Results

Microcryogels 3D microtissue oluşumu için malzemelerin ve üretim. Bu protokole göre microcryogels microcryogel diziler ve bireysel microcryogels veya form 3D microtissues fabrikasyon ve rejeneratif terapi ve ilaç (şekil 1) tarama, sırasıyla uygulandı. Microstencil dizi cips PMMA fabrikasyon olarak micromolds microcryogel dizi patates kızartması için uygulandı. Değişke…

Discussion

Rejeneratif tıp ve vitro ilaç tarama için doku Mühendisliği5,6,7,8,9için iki önemli uygulamalar modellerdir. Bu iki uygulama büyük ölçüde farklı ihtiyaçları varken, bunların arasında ortak bir zemin hücre fonksiyonları19geliştirmek için koşulu kültür bir daha fazla biomimetic için ihtiyaç yatıyor. Yal…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser mali Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin tarafından desteklenmiştir (hibe: 81522022, 51461165302). Yazarlar tüm Du laboratuvar üyeler genel yardım için kabul etmek istiyorum.

Materials

Gelatin sigma G7041 All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.
Glutaraldehyde  J&K 902042 Used as crosslinker in preparation of material.
Glass cover slip (24X50mm) CITOGLASS, China 10212450C To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.
Sodium borohydride, NaBH4 Beijing Chemical Works 116-8 To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.
Vacuum jar asperts, China VC8130 To preserve microgels under vacuum.
Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets  Sunjin Electronics Co., Ltd, China Ordinary PMMA sheets.
Rayjet laser system Rayjet, Australia Rayjet 50 C30 To engrave PMMA sheets to form wells.
Plasma Cleaner Mycro Technologies, USA PDC-32G To make PMMA hyphophilic.
Lyophilizer Boyikang, China SC21CL To lyophilize materials.
Trypan Blue solution (0.4%) Zhongkekeao, China DA0065 To dye microgels.
Doxorubicin hydrochloride ENERGY CHEMICAL, China A01E0801360010 To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.
Live/dead assay Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan) CS01-10 To distinguish alive and dead cells.
Cell Titer-Blue Promega (Wisconsin, USA). G8080 To test cell viability.
Cell strainer BD Biosciences, USA 352360 To collect microgels.
D-Luciferin SYNCHEM (Germany) s039 To tack cells.
Scanning electron microscope FEI, USA Quanta 200 To characterize microgel morphology.
 Mechanical testing machine Bose, USA 3230 To measure mechanical features.
Programmable syringe pump  World Precision Instruments, USA ALADINI 1000 To test injactabiliy.
Digital force gauge HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China H-50  To test injactabiliy.
Ethylene oxide sterilization system Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC AN74i To sterilize microgels with ethylene oxide gas.
Microplate reader Molecular Devices,USA M5 To measure fluorescence intensity in micro-array.
Confocal microscope Nikon, Japan A1Rsi To observe cell distribution in 3D.
Xenogen  Lumina II imaging system Caliper Life Sciences, USA IVIS To track cell in animals.
Liquid work stataion Apricot design,USA S-pipette To load medium or cell suspension high-throuputly.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  3. Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
  4. Fischbach, M. A., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine. Sci Transl Med. 5 (179), 179 (2013).
  5. Kuraitis, D., Giordano, C., Ruel, M., Musaro, A., Suuronen, E. J. Exploiting extracellular matrix-stem cell interactions: a review of natural materials for therapeutic muscle regeneration. Biomaterials. 33 (2), 428-443 (2012).
  6. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  7. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay Drug Dev Technol. 11 (7), 435-448 (2013).
  8. Yoshii, Y., et al. High-throughput screening with nanoimprinting 3D culture for efficient drug development by mimicking the tumor environment. Biomaterials. 51, 278-289 (2015).
  9. Li, X., et al. Micro-scaffold array chip for upgrading cell-based high-throughput drug testing to 3D using benchtop equipment. Lab Chip. 14 (3), 471-481 (2014).
  10. Qi, C., Yan, X., Huang, C., Melerzanov, A., Du, Y. Biomaterials as carrier, barrier and reactor for cell-based regenerative medicine. Protein Cell. 6 (9), 638-653 (2015).
  11. Li, Y., et al. Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13511-13516 (2014).
  12. Liu, W., et al. Magnetically controllable 3D microtissues based on magnetic microcryogels. Lab Chip. 14 (15), 2614-2625 (2014).
  13. Zhao, S., Zhao, H., Zhang, X., Li, Y., Du, Y. Off-the-shelf microsponge arrays for facile and efficient construction of miniaturized 3D cellular microenvironments for versatile cell-based assays. Lab Chip. 13 (12), 2350-2358 (2013).
  14. Liu, W., et al. Microcryogels as injectable 3-D cellular microniches for site-directed and augmented cell delivery. Acta Biomater. 10 (5), 1864-1875 (2014).
  15. Hakanson, M., et al. Controlled breast cancer microarrays for the deconvolution of cellular multilayering and density effects upon drug responses. PLoS One. 7 (6), e40141 (2012).
  16. Du, Y., et al. Rapid generation of spatially and temporally controllable long-range concentration gradients in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (6), 761-767 (2009).
  17. He, J., et al. Microfluidic synthesis of composite cross-gradient materials for investigating cell-biomaterial interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 175-185 (2011).
  18. Zeng, Y., et al. Preformed gelatin microcryogels as injectable cell carriers for enhanced skin wound healing. Acta Biomater. 25, 291-303 (2015).
  19. Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3317-3322 (2010).
  20. Zhang, L., et al. Delayed administration of human umbilical tissue-derived cells improved neurological functional recovery in a rodent model of focal ischemia. Stroke. 42 (5), 1437-1444 (2011).
  21. Kinnaird, T., et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation. 109 (12), 1543-1549 (2004).
  22. Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds. Nat Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
  23. Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
  24. Gimble, J. M., Guilak, F., Bunnell, B. A. Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissue-derived cells. Stem Cell Res Ther. 1 (2), (2010).
  25. Thai, H. M., et al. Implantation of a three-dimensional fibroblast matrix improves left ventricular function and blood flow after acute myocardial infarction. Cell Transplant. 18 (3), 283-295 (2009).
  26. Moreira Teixeira, L. S., et al. High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage formation in vitro and in vivo. Eur Cell Mater. 23, 387-399 (2012).
  27. Ifkovits, J. L., et al. Injectable hydrogel properties influence infarct expansion and extent of postinfarction left ventricular remodeling in an ovine model. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (25), 11507-11512 (2010).
  28. Murphy, A. R., Laslett, A., O’Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomater. , (2017).
  29. Cheng, V., et al. High-content analysis of tumour cell invasion in three-dimensional spheroid assays. Oncoscience. 2 (6), 596-606 (2015).
  30. Huber, J. M., et al. Evaluation of assays for drug efficacy in a three-dimensional model of the lung. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (9), 1955-1966 (2016).
  31. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment in vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BMC Cancer. 16, 581 (2016).
  32. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  33. Monjaret, F., et al. Fully Automated One-Step Production of Functional 3D Tumor Spheroids for High-Content Screening. J Lab Autom. 21 (2), 268-280 (2016).
  34. Shologu, N., et al. Recreating complex pathophysiologies in vitro with extracellular matrix surrogates for anticancer therapeutics screening. Drug Discov Today. 21 (9), 1521-1531 (2016).
  35. Ho, W. J., et al. Incorporation of multicellular spheroids into 3-D polymeric scaffolds provides an improved tumor model for screening anticancer drugs. Cancer Sci. 101 (12), 2637-2643 (2010).
  36. Pathak, A., Kumar, S. Independent regulation of tumor cell migration by matrix stiffness and confinement. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (26), 10334-10339 (2012).
  37. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nat Cell Biol. 17 (5), 678-688 (2015).
  38. Romero-Lopez, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  39. Xu, X., Sabanayagam, C. R., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Jia, X. A hydrogel-based tumor model for the evaluation of nanoparticle-based cancer therapeutics. Biomaterials. 35 (10), 3319-3330 (2014).
  40. Xu, X., et al. Recreating the tumor microenvironment in a bilayer, hyaluronic acid hydrogel construct for the growth of prostate cancer spheroids. Biomaterials. 33 (35), 9049-9060 (2012).
  41. Nyga, A., Loizidou, M., Emberton, M., Cheema, U. A novel tissue engineered three-dimensional in vitro colorectal cancer model. Acta Biomater. 9 (8), 7917-7926 (2013).
  42. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochem Biophys Res Commun. 433 (3), 327-332 (2013).
  43. Hoare, T. R., Kohane, D. S. Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges. Polymer. 49 (8), 1993-2007 (2008).
  44. Delgado, L. M., Bayon, Y., Pandit, A., Zeugolis, D. I. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 298-313 (2015).
  45. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  46. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  47. Zhang, M., Boughton, P., Rose, B., Lee, C. S., Hong, A. M. The use of porous scaffold as a tumor model. Int J Biomater. 2013, 396056 (2013).
  48. Wang, J., et al. Engineering EMT using 3D micro-scaffold to promote hepatic functions for drug hepatotoxicity evaluation. Biomaterials. 91, 11-22 (2016).

Tags

Regenerative TherapyDrug ScreeningCryogelationGelatinMicrocryogelsPMMA MicrostencilPDMS Ejector PinLyophilizationHigh-throughput
check_url/fr/55982?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Li, Y., Yan, X., Liu, W., Zhou, L., You, Z., Du, Y. 3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening. J. Vis. Exp. (128), e55982, doi:10.3791/55982 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image