Chondrogenic גלולה היווצרות דם טבורי הנגזרות Pluripotent תאים גזעיים
Summary
כאן, אנו מציעים פרוטוקול לבידול chondrogenic מ דם טבורי mononuclear תאים נגזר האדם המושרה בתאי גזע pluripotent.
Abstract
לסחוס המפרקי של האדם אין יכולת לתקן את עצמו. ניוון הסחוס ולכן מטופל לא על ידי טיפולים שמרניים אלא על ידי שמרני. נכון לעכשיו, המאמצים נעשים כדי לחדש סחוס פגום עם chivrocytes לשעבר vivo מורחבת או מוח העצם נגזר תאי גזע mesenchymal (BMSCs). עם זאת, המוגבלות הכדאיות וחוסר היציבות של תאים אלה להגביל את היישום שלהם שחזור סחוס. תאי גזע pluripotent האדם המושרה (hiPSCs) קיבלו תשומת לב מדעית כחלופה חדשה ליישומים משובי. עם יכולת חידוש עצמי בלתי מוגבלת ורב-יכולות, hiPSCs הודגשו כמקור חלופי חדש לתיקון סחוס. עם זאת, השגת כמות גבוהה של כדורי chondrogenic באיכות גבוהה היא אתגר גדול היישום הקליני שלהם. במחקר זה, השתמשנו בתאי גדילה של תאי גופרית (EB). CHondrogenesis מוצלח אושרה על ידי PCR אD מכתים עם כחול alcian, כחול toluidine, ונוגדנים נגד סוגי קולגן I ו- II (COL1A1 ו COL2A1, בהתאמה). אנו מספקים שיטה מפורטת להבדיל של דם טבורי mononuclear תא נגזר iPSCs (CBMC-hiPSCs) לתוך כדורי chondrogenic.
Introduction
השימוש hiPSCs מייצג אסטרטגיה חדשה עבור בדיקות סמים ומחקרים מכניסטיים של מחלות שונות. מנקודת מבט משובי, hiPSCs הם גם מקור פוטנציאלי להחלפת רקמות שנפגעו בעלי יכולת ריפוי מוגבלת, כגון סחוס מפרקי 1 , 2 .
התחדשות של סחוס articular יליד כבר אתגר במשך כמה עשרות שנים. סחוס המפרק הוא רקמה רכה, לבנה, המעטפת את קצה העצמות ומגינה עליהם מפני חיכוך. עם זאת, יש לו יכולת regenerative מוגבל כאשר פגום, מה שהופך תיקון עצמי כמעט בלתי אפשרי. לכן, מחקר התמקדות התחדשות הסחוס כבר מתמשך במשך כמה עשורים.
בעבר, ב מבחנה חוץ גופית לתוך השושלת chondrogenic בוצעה בדרך כלל עם BMSCs או chondrocytes יליד מבודד מפרק הברך 3 . בשל TO הפוטנציאל chondrogenic שלהם, BMSCs ו chondrocytes יליד יש יתרונות רבים התומכים בשימוש שלהם chondrogenesis. עם זאת, בשל ההתפשטות המוגבלת שלהם פנוטיפ יציב, תאים אלה בפני מספר מגבלות שחזור של מומים הסחוס המפרקי. תחת תנאים תרבות חוץ גופית , תאים אלה נוטים לאבד את המאפיינים שלהם לאחר 3-4 מעברים, אשר בסופו של דבר משפיע על יכולות ההבחנה שלהם 4 . כמו כן, במקרה של chondrocytes יליד, נזק נוסף למפרק הברך הוא בלתי נמנע בעת קבלת תאים אלה.
שלא כמו BMSCs או chondrocytes יליד, hiPSCs יכול להאריך ללא הגבלת במבחנה . עם התנאים תרבות נאותה, hiPSCs יש פוטנציאל גדול כמקור חלופי עבור בידול chondrogenic. עם זאת, זה מאתגר לשנות את המאפיינים המהותיים של hiPSCs 5 . יתר על כן, זה לוקח כמה מסובך במבחנה stePS לכוון את גורלם של hiPSCs לסוג תא מסוים. למרות סיבוכים אלה, השימוש hiPSCs עדיין מומלץ בשל יכולת ההתחדשות העצמית שלהם ואת יכולתם להבדיל תאים ממוקד, כולל chondrocytes 6 .
בידול chondrogenic נעשה בדרך כלל עם מערכות תרבות תלת מימדי, כגון תרבות גלולה או תרבות micromass, באמצעות תאים MSC כמו. אם באמצעות hiPSCs, פרוטוקול לייצר תאים כמו MSC כמו שונה הפרוטוקולים הקיימים. כמה קבוצות להשתמש בתרבות monolayer של hiPSCs כדי להמיר ישירות את הפנוטיפ לתוך תאים כמו MSC 7 . עם זאת, רוב המחקרים משתמשים ב- EBS כדי ליצור תאי תמותה הדומים ל- MSC 8 , 9 , 10 , 11 .
סוגים שונים של גורמי גדילה משמשים לגרום chondrogeNesis. בדרך כלל, BMP ו TGFβ משפחה חלבונים משמשים, לבד או בשילוב. הבידול גם הוא המושרה עם גורמים אחרים, כגון GDF5, FGF2, ו IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . TGFβ1 הוכח לעורר chondrogenesis באופן תלוי מינון MSCs 16 . בהשוואה לאיזוטופיפ השני, TGFβ3, TGFβ1 גורם chondrogenesis על ידי הגדלת pre-cartilage תא התעבות mesenchymal מראש. TGFβ3 גורם chondrogenesis על ידי הגדלה משמעותית של התפשטות תאים mesenchymal 17 . עם זאת, TGFβ3 משמש לעתים קרובות יותר על ידי חוקרים מאשר TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 משפר את הביטוי של גנים הקשורים רכיבים chondrogenic מטריקס האדםChondrocytes מפרקי תחת בתנאים חוץ גופית 20 . BMP2 מגביר את הביטוי של גנים קריטיים להיווצרות סחוס ב- MSCs בשילוב עם חלבונים TGFβ 21 . כמו כן הוכח כי BMP2 סינרגיסטי משפר את ההשפעה של TGFβ3 דרך מסלולי Smad ו- MAPK 22 .
במחקר זה, CBMC-hiPSCs היו מצטברים לתוך EBS באמצעות EB בינוני בצלחת פטרי מצורף נמוך. תאי תולדה נגרמו על ידי הצמדת ה- EBS לצלחת מצופה ג'לטין. בידול chondrogenic באמצעות תאים תולדה בוצעה על ידי תרבות גלולה. טיפול עם שני BMP2 ו TGFβ3 בהצלחה מרוכז התאים המושרה תאי מטריקס תאי (ECM) הצטברות חלבון עבור היווצרות chondrogenic גלולה. מחקר זה מציע פרוטוקול בידול chondrogenic פשוטה אך יעילה באמצעות CBMC-hiPSCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה נוצר בהצלחה hiPSCs מ CBMCs. אנחנו תכנות מחדש CBMCs כדי hiPSCs באמצעות וקטור ויראלי Sendai המכיל גורמים Yamanaka 24 . שלושה מקרים שימשו בידול, וכל הניסויים בהצלחה נוצר chondrogenic pellets באמצעות פרוטוקול זה. מחקרים רבים דיווחו על פרוטוקולים להבחנה של hiPSCs לתוך chondrocytes <sup cl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהפרויקט למחקר ופיתוח של טכנולוגיה בקוריאה, משרד הבריאות, הרווחה והמשפחה, הרפובליקה של קוריאה (HI16C2177).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Description |
| E8 Medium Materials | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | E8 Medium (500 mL) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | E8 Medium (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | E8 Medium (Conc.: 100 ng/mL) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | E8 Medium (Conc.: 64 μg/mL) |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Name | Company | Catalog Number | Description |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Alcian blue | Sigma Aldrich | A3157-10G | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252-25G | |
| Safranin O | Sigma Aldrich | 090m0039v | |
| Nuclear fast red | Americanmastertech | STNFR100 | |
| xylene | Duksan | 115 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| Mayer's hematoxylin solution | wako pure chemical industries | LAK7534 | |
| DAP | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| Name | Company | Catalog Number | Description |
| Chondrogenic Differentiation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | Chondrogenic media component (500 mL) |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM) |
| rhBMP-2 | R&D | 355-BM-050 | Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml) |
| Recombinant Hman TGF-beta3 | R&D | 243-B3-002 | Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml) |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| ITS+ Premix | BD | 354352 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma Aldrich | D2915-100MG | Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M) |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| Sodium pyruvate solution | Sigma Aldrich | S8636 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P5607-25G | Chondrogenic media component (40μg/ml) |
References
- van Osch, G. J., et al. Cartilage repair: past and future–lessons for regenerative medicine. J Cell Mol Med. 13 (5), 792-810 (2009).
- Ahmed, T. A., Hincke, M. T. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 305-329 (2010).
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Solchaga, L. A., Penick, K., Goldberg, V. M., Caplan, A. I., Welter, J. F. Fibroblast growth factor-2 enhances proliferation and delays loss of chondrogenic potential in human adult bone-marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1009-1019 (2010).
- Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods Mol Biol. 1340, 79-95 (2015).
- Drissi, H., Gibson, J. D., Guzzo, R. M., Xu, R. H. Derivation and Chondrogenic Commitment of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Progenitors. Methods Mol Biol. 1340, 65-78 (2015).
- Nejadnik, H., et al. Improved approach for chondrogenic differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 11 (2), 242-253 (2015).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Ko, J. Y., Kim, K. I., Park, S., Im, G. I. In vitro chondrogenesis and in vivo repair of osteochondral defect with human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (11), 3571-3581 (2014).
- Nam, Y., Rim, Y. A., Jung, S. M., Ju, J. H. Cord blood cell-derived iPSCs as a new candidate for chondrogenic differentiation and cartilage regeneration. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 16 (2017).
- Hotten, G. C., et al. Recombinant human growth/differentiation factor 5 stimulates mesenchyme aggregation and chondrogenesis responsible for the skeletal development of limbs. Growth Factors. 13 (1-2), 65-74 (1996).
- Murphy, M. K., Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. TGF-beta1, GDF-5, and BMP-2 stimulation induces chondrogenesis in expanded human articular chondrocytes and marrow-derived stromal cells. Stem Cells. 33 (3), 762-773 (2015).
- Shintani, N., Siebenrock, K. A., Hunziker, E. B. TGF-ss1 enhances the BMP-2-induced chondrogenesis of bovine synovial explants and arrests downstream differentiation at an early stage of hypertrophy. PLoS One. 8 (1), e53086 (2013).
- Fukumoto, T., et al. Combined effects of insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro. Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 55-64 (2003).
- Worster, A. A., Nixon, A. J., Brower-Toland, B. D., Williams, J. Effect of transforming growth factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 61 (9), 1003-1010 (2000).
- Knippenberg, M., et al. Differential effects of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta1 on gene expression of collagen-modifying enzymes in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 15 (8), 2213-2225 (2009).
- Jang, Y., et al. Centrifugal gravity-induced BMP4 induces chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells via SOX9 upregulation. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 184 (2016).
- Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Res Ther. 6, 144 (2015).
- Tao, H., et al. Biological evaluation of human degenerated nucleus pulposus cells in functionalized self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1621-1631 (2014).
- Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Reger, R. L., Prockop, D. J. Comparison of effect of BMP-2, -4, and -6 on in vitro cartilage formation of human adult stem cells from bone marrow stroma. Cell Tissue Res. 320 (2), 269-276 (2005).
- Shen, B., Wei, A., Tao, H., Diwan, A. D., Ma, D. D. BMP-2 enhances TGF-beta3-mediated chondrogenic differentiation of human bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in alginate bead culture. Tissue Eng Part A. 15 (6), 1311-1320 (2009).
- Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J Vis Exp. (118), (2016).
- Kim, Y., et al. The Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Blood Cells: An Efficient Protocol Using Serial Plating of Reprogrammed Cells by Centrifugation. Stem Cells Int. 2016, 1329459 (2016).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Toh, W. S., et al. Differentiation and enrichment of expandable chondrogenic cells from human embryonic stem cells in vitro. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3570-3590 (2009).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Derivation of chondrogenically-committed cells from human embryonic cells for cartilage tissue regeneration. PLoS One. 3 (6), e2498 (2008).
- Nakagawa, T., Lee, S. Y., Reddi, A. H. Induction of chondrogenesis from human embryonic stem cells without embryoid body formation by bone morphogenetic protein 7 and transforming growth factor beta1. Arthritis Rheum. 60 (12), 3686-3692 (2009).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients. J Vis Exp. (116), (2016).
- Pfaff, N., et al. Efficient hematopoietic redifferentiation of induced pluripotent stem cells derived from primitive murine bone marrow cells. Stem Cells Dev. 21 (5), 689-701 (2012).
- Xu, H., et al. Highly efficient derivation of ventricular cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells with a distinct epigenetic signature. Cell Res. 22 (1), 142-154 (2012).
- Lee, S. B., et al. Contribution of hepatic lineage stage-specific donor memory to the differential potential of induced mouse pluripotent stem cells. Stem Cells. 30 (5), 997-1007 (2012).
- Hu, S., et al. Effects of cellular origin on differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells. JCI Insight. 1 (8), 1-12 (2016).
- Vonk, L. A., de Windt, T. S., Slaper-Cortenbach, I. C., Saris, D. B. Autologous, allogeneic, induced pluripotent stem cell or a combination stem cell therapy? Where are we headed in cartilage repair and why: a concise review. Stem Cell Res Ther. 6 (94), 1-11 (2015).
- Gomez-Leduc, T., et al. Chondrogenic commitment of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in collagen matrices for cartilage engineering. Sci Rep. 6, 32786 (2016).
- Mareschi, K., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. Haematologica. 86 (10), 1099-1100 (2001).
- Wexler, S. A., et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal ‘stem’ cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol. 121 (2), 368-374 (2003).
- Zhang, X., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood: reevaluation of critical factors for successful isolation and high ability to proliferate and differentiate to chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue. J Cell Biochem. 112 (4), 1206-1218 (2011).
- Wagner, W., et al. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process. PLoS One. 3 (5), e2213 (2008).
- Tarte, K., et al. Clinical-grade production of human mesenchymal stromal cells: occurrence of aneuploidy without transformation. Blood. 115 (8), 1549-1553 (2010).
- Chen, W. C., et al. Prediction of poor survival by cyclooxygenase-2 in patients with T4 nasopharyngeal cancer treated by radiation therapy: clinical and in vitro studies. Head Neck. 27 (6), 503-512 (2005).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
