Kommer til lys Side: I Vivo overvåking av Pseudomonas aeruginosa Biofilm infeksjoner i kroniske sår i en diabetiker Hairless Murine modell

Summary

Her beskriver vi en roman diabetiker murine modell utnytte hairless mus for sanntid, ikke-invasiv, overvåking av biofilm sårinfeksjoner av bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. Denne metoden kan tilpasses å evaluere infeksjon i andre bakterie-art og genmodifiserte mikroorganismer, inkludert flere arter biofilm, og teste effekten av antibiofilm strategier.

Abstract

Tilstedeværelsen av bakterier som strukturert biofilm i kroniske sår, spesielt i diabetespasienter, antas å hindre sårheling og oppløsning. Kronisk musen sår modeller har blitt brukt for forstå underliggende samspillet mellom mikroorganismer og verten. Modeller utviklet ennå stole på bruk av håret dyr og terminal samling av såret vev for fastsettelse av levedyktig bakterier. Mens betydelig innsikt har fått med disse modellene, denne eksperimentelle prosedyren krever et stort antall dyr og prøvetaking er tidkrevende. Vi har utviklet en roman murine modell som flere optimal evaluere biofilm progresjon i kroniske sår: en) den utnytter hairless mus, eliminerer behovet for hårfjerning; b) gjelder pre-formet biofilm sår tillater for umiddelbar evalueringen av utholdenhet og effekten av disse samfunnene på host; c) overvåker biofilm progresjon av kvantifisere lys produksjon av en genmodifisert bioluminescent stamme av Pseudomonas aeruginosa, slik at sanntids overvåking av infeksjonen dermed redusere antall dyr må etter studien. I denne modellen er et enkelt full-dybde sår produsert på baksiden av STZ-indusert diabetiker hairless mus og inokulert med biofilm av P. aeruginosa bioluminescent belastningen Xen 41. Lys-output fra sårene registreres daglig i en i vivo tenkelig system, slik at i vivo og i situ rask biofilm visualisering og lokalisering av biofilm bakterier i sårene. Denne romanen metoden er fleksibel som det kan brukes å studere andre mikroorganismer, inkludert genmodifiserte arter og flere arter biofilm, og kan være av spesiell verdi i testing anti-biofilm strategier, inkludert antimikrobielle occlusive bandasjer.

Introduction

Biofilm er komplekse samfunn av mikroorganismer i en matrise polymere stoffer som har blitt markert som en medvirkende faktor for dårlig løsning av kroniske sår¹. Studiet av disse godt organisert, vedvarende mikrobielle populasjoner er spesielt viktig for diabetiker pasienter hvor dårlig sirkulasjon på lemmer og endret perifere sensoriske mekanismer føre til uoppdaget lesjoner². I USA anslås det at 15% av diabetespasienter vil utvikle minst én sår i løpet av livet. Dette betyr en økonomisk utgift på rundt 28 milliarder dollar behandling^3,4, for ikke for å nevne immensurable følelsesmessige og sosiale byrden. Forstå faktorene at mikrobielle samfunn å vedvare i såret sengen og effekten disse biofilm har i helbredende hendelsene er viktig å kjøre bedre omsorg for pasientene påvirkes og drive utviklingen av nye behandlingsmetoder. Derfor er etableringen av reproduserbar og oversettbare i vivo modeller for å utforske bakteriell vert interaksjoner avgjørende.

Murine modeller har blitt utviklet for å studere virkningen av biofilm i kroniske sår. Disse modellene, men ofte utnytte håret arter og evaluere biofilm klarering av platen teller levedyktig bakterieceller forbrukeravgift vev fra ofret dyr, noe som gjør dem tidkrevende og kostbare.

Et biophotonic alternativ til endepunktet prøvetaking av dyr i evaluering infeksjon ble først foreslått av Contag et al. (1995) ^{5 ,} som utviklet en metode for å fange luminescence fra constitutively bioluminescent Salmonella typhimurium å måle antibiotikabehandling effekt. Andre studier utnytter bioluminescens-emitting bakterier fulgte. For eksempel Rochetta et al. (2001) ⁶ godkjent en infeksjon modell for å studere Escherichia coli lår infeksjoner i mus ved å måle luminescence bruker en intensivert kostnad – sammen enhet og senere, Kadurugamuwa et al. (2003) ⁷ dro fordel av Foton emitting egenskapene til en konstruert stamme av Staphylococcus aureus å undersøke effekten av flere antibiotika i et kateter såret modellen i mus.

Metoden preget Her presenterer en enkel protokoll for å få diabetes i hairless mus, produsere og vaksinere sår med pre-formet bioluminescent biofilm av P. aeruginosa, og utføre biophotonic overvåking av infeksjon med en i vivo imaging system. Det tilbyr en direkte rask i situ, ikke-invasiv og kvantitativ prosessen å evaluere biofilm i kroniske sår og i tillegg gir ytterligere analyse som mikroskopiske bildebehandling av healing sår, intermitterende blod samling for cytokin målinger og terminal vev samling for histology.

Protocol

dyreforsøk ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Michigan State University. 1. forberedelse av Occlusive dressinger og silikon avstandsstykker kuttet gjennomsiktig occlusive dressing å gjøre rutene ca 1 cm x 1 cm med saks. Kutte 10 mm sirkler på 0,5 mm tykk silikon ark bruker en 10 mm biopsi punch. Center en 5 mm biopsi punch i 10 mm sirkelen og trykk fast for å lage et hull å danne en " bolle "-som plate som skal brukes som en spli…

Representative Results

I utviklingen av denne nye modellen, observerte vi mange fordeler i å utnytte naken SKH-1 over C57BL/6J mus, som vi har brukt tidligere. Dyr utsatt for STZ injeksjoner normalt oppleve gradvis vekttap med utbruddet av diabetes; imidlertid utført sår helbredelse eksperimenter tidligere av våre laboratorier gjengi modellen presentert av Dunn et al. (2012) 9 bruker C57BL/6J, drastiske vekttap ble observert (figur 1). I kontras…

Discussion

Her beskriver vi en ny musemodell for å studere biofilm i diabetiker kroniske sår som har mange fordeler med å opprette en reproduserbare, oversettbare og fleksibel modell.

Den første innovasjonen er bruk av hairless mus. Andre mus modeller er utviklet for å studere diabetiker kronisk sårheling^10,11, men alle har stolt på bruk av håret mus krever fjerning av pelsen av prosesser som involverer enten voksing eller hår klipping k…

Materials

Opsite	Smith & Nephew	Model 66000041	Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr	Charles River Breeding Laboratories	SKH1	Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ)	Sigma Aldrich	S0130-1G	Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer	Accu-Chek Roche	Art No. 05046025001	ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41	Perkin Elmer	119229	Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters	Sigma Aldrich	P9199	Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D8537	PBS
Tryptic soy agar	Sigma Aldrich	22091	Culture agar
Meloxicam	Henry Schein Animal Health	49755	Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine)	Purdue Products LP	301879-OA	Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	AAJ61899AK	Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube	Fisher Scientific	22-362-566	Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints	Invitrogen Life Technologies Corp	P-18178	Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth	Sigma Aldrich	22092	Culture broth
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber	Perkin Elmer	123997	XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter	Teleflex	28022	Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-142	Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-140	Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose	J.T.Baker	1916-01	Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid	Sigma Aldrich	C2404-100G	Citric Acid
Mastisol	Eloquest Healthcare	HRI 0496-0523-48	Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates	Fisher Scientific	07-200-567	96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle	BD	305122	Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	N/A	Ultrasonic Cleaner