Yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve Adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz Yönetim için ipuçları
Summary
Fareyi bir geniş ölçekli merkezi sinir sistemi gen teslimi için yöntemleri kaplıdır. Bu örnekte, amacı tüm omurilik etkileyen bir hastalık taklit etmektir. Yaygın iletim bir terapötik protein MSS için bir kerelik, Çevre Yönetimi’nden teslim etmek için kullanılabilir.
Abstract
Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörleridir Nörobilim anahtar bir reaktif kümelenmiş için düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR), optogenetics, cre-lox hedefleme, vb. Bu yazının amacı geniş merkezi sinir sistemi (MSS) gen transferi kuyruk ven enjeksiyon AAV fare içinde çalışan araştırmacı yardım etmektir. Geniş ölçekli ifade koşulları yaygın patoloji ile ilgilidir ve bir fare modeli büyük boyutu ve fareler için karşılaştırıldığında insanlar fizyolojik benzerlikler nedeniyle önemlidir. Bu örnek uygulamada geniş ölçekli nöronal iletim tüm spinal kord, amyotrofik lateral skleroz (ALS) etkiler bir nörodejeneratif hastalık taklit etmek için kullanılır. Verimli geniş ölçekli CNS iletim terapötik protein faktörleri önceden klinik çalışmalarda sunmak için de kullanılabilir. Birkaç hafta sonra bir sonrası enjeksiyon ifade aralığı, iletim etkileri değerlendirilir. Yeşil flüoresan protein (GFP) denetim vektör için beyincik GFP miktarını hızla ve güvenle temel bir görüntüleme programı tarafından tahmin edilmektedir. ALS tarafından indüklenir motor hastalığı fenotipleri protein transactive yanıt 43 kDa (TDP-43) DNA’ya bağlanıcı protein ilgili için açıkları kaçış refleks ve rotarod tarafından attı. Hastalık modelleme ve gen tedavisi dışında geniş ölçekli gene burada açıklanan hedefleme için çeşitli potansiyel uygulamalar vardır. Bu yöntemin Genişletilmiş Kullanım Hipotez testleri sinir ve neurogenetics hızlandırdığını yardımcı olacak.
Introduction
Nöronlar içinde vivo transducing için verimli oldukları için rekombinant adeno ilişkili virüs (AAV) CNS araştırma için vazgeçilmez araçları vektörleridir. AAV vektörel çizimler farklı transgenes ve protein izoformlarının, farklı doku, farklı ana türler ve yönetim farklı yolları eğitimi için çok yönlü vardır. Örneğin, AAV fareler için çevresel, nispeten nöronlar MSS boyunca ilk olarak transduce için intravenöz enjeksiyon Foust vd ve Duque vd.’da açıklanan invazif olmayan, tarafından yönetilemez duruma gelir (bkz: JÜPİTER tarafından kağıt Gombash vd. (2014)). 1 , 2 , 3 bu gen teslim yaklaşım fareler verimli bir şekilde her iki yeşil flüoresan protein (GFP) ifade etmek için kullanılan veya ALS ilgili protein, transactive Yanıt MSS 43 kDa (TDP-43) DNA’ya bağlanıcı protein. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 Rat sıçan fizyolojik ve metabolik parametreleri insanlar fareler karşılaştırıldığında daha yakın olduğundan ve davranışsal ve toksikolojik deneyleri özellikle fareler için tasarlanmış önemli çalışıyor. Ayrıca, daha fazla transgenik fare çizgi kullanılabilir hale gelmektedir bu AAV gen transferi çalışmalarda kullanılan.
Yöntemleri geniş CNS gen transferi fare ve hızlı, güvenilir miktar sonuçlar için ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Geniş ölçekli CNS iletim ALS belirtiler Sıçanlarda TDP-43 spinal kord ifade ederek taklit etmek için kullanılır. TDP-43 vektör olarak Jackson ve ark. kullanılan genç yetişkin fareler için kuyruk ven enjeksiyonu yöntemidir 6 , 8 , 9 motor açıkları TDP-43-indüklenen tarafından iki yöntem birkaç hafta sonra attı: kaçış refleks ve Dayton vd ve Jackson ve ark. kullanılan gibi rotarod 5 , 6 , 7 , 9 denetim GFP vektör, otopsi analizi, beyincik floresan alan Jackson ve ark. içinde kullanılan iletim verimliliği dizini olarak hesaplanır 6 , 8 beyincik analiz CNS iletim periferik gen teslim sonra derece hızlı ve güvenilir bir dizin olduğu kanıtlanmıştır ve periferik orta gen transferi çalışırken yaklaşımlar çeşitli için uygulanabilir olmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teslimat rotalarını çeşitli AAV vektörel çizimler için test: içi parenkimal, içi-cerebroventricular, içi thecal, intravenöz, burunici, intra kas, vs. Her yol belirli avantajları hem de dezavantajları var. Kuyruk ven AAV yetişkin fareler için MSS tutarlı iletim ulaşmak için güvenilir bir yöntem bir ilçedir. Periferik enjeksiyon yöntemi bir enjeksiyon kanül giriş içine belgili tanımlık CNS doku önler ve bu nedenle minimal invaziv. Bu yöntemle elde verimli CNS ifade tekniği en büyük avantajı…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser ALS Derneği, Karyopharm tedavi, Inc, Meira GTx ve Thomas Lawson, kendisi için minnettarız ALS araştırma için bir hayırsever bağış tarafından finanse edildi. Biz Elysse Orchard ve Donna Burney tavsiye ve eğitim için teşekkür ederiz. JAS yalan Vakfı tarafından desteklenen ve ulusal sağlık Enstitüleri GM103418 verin.
Materials
| Scale | Pelouze | SP5 | |
| Nalgene bucket | Thermo Scientific | 12014000 | 4000 mL |
| Microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Lactated Ringer's Solution | Baxter Healthcare | 0338-0114-04 | |
| Mini vortexer | Fisher Scientific | 128101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22624415 | |
| Laboratory film | Bemis | PM996 | |
| 1-mL syringe | BD | 309626 | Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection |
| 30g needle | BD | 305106 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | Isoflurane USP 250 mL |
| Anesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Gauze | Henry Schein | 100-2524 | 2" x 2" (5cm x 5cm) |
| Pipet tips | USA Scientific | 1111-0816 | |
| Micropipet | Gilson | 4642080 | |
| Gas anesthesia vaporizer | SurgiVet | 4214322 | Classic T3 |
| Gas anesthesia scavenger | SurgiVet | 32373B10 | Enviro-PURE |
| Heating pad | Sears | 17280 | |
| Bench pad | VWR | 56617-006 | |
| Rotarod | Panlab/Harvard Apparatus | 76-0772 | 4 rats/ 4 mice |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2401 | 140 proof |
| 70% Isopropanol | VWR | 89108-160 | |
| Scion Image | Scion Corporation | ||
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen | A11122 | Primary Antibody – 1:500 dilution |
| AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11070 | Secondary Antibody – 1:300 dilution |
| Axioskop 40 microscope | Zeiss |
References
- Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
- Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
- Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
- Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).
- Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
- Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).
- Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69 (2016).
- Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
- Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
- van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).
