Détection de cellules progénitrices de donateurs résiduelle érythroïdes après Transplantation de cellules souches hématopoïétiques pour les Patients ayant des hémoglobinopathies

Summary

Quantification des cellules dérivées de donateurs est nécessaire pour contrôler la prise de greffe après greffe de cellules souches chez les patients atteints d’hémoglobinopathies. Une combinaison de tri de cellule axée sur la cytométrie en flux, analyse de la formation de colonie et analyse subséquente du tandem courte répétitions peuvent être employées pour évaluer la prolifération et la différenciation des cellules souches dans le compartiment érythroïde.

Abstract

La présence de chimérisme incomplète est notée dans une grande proportion de patients après greffe de moelle osseuse pour la thalassémie ou la drépanocytose. Cette observation a des implications énormes, comme stratégies d’immunomodulation thérapeutique ultérieure peuvent améliorer les résultats cliniques. Conventionnellement, analyse axée sur la réaction en chaîne de la polymérase de séquences répétées en tandem courtes sert à identifier chimérisme dans les cellules de sang provenant de donneurs. Toutefois, cette méthode est limitée aux cellules nucléées et ne peut pas distinguer entre deux lignées unicellulaires dissociées. Nous avons appliqué l’analyse de séquences répétées en tandem courtes à l’écoulement des cellules progénitrices hématopoïétiques triée par cytométrie en flux et comparé cela avec l’analyse de séquences répétées en tandem courte provenant d’unité formant des rafale sélectionnée - colonies érythroïdes, tous deux prélevés dans l’OS moelle osseuse. Avec cette méthode, nous sommes en mesure de démontrer les différente prolifération et la différenciation des cellules du donneur dans le compartiment érythroïde. Cette technique a le droit de compléter la surveillance actuelle de chimérisme dans la greffe de cellules souches définissant et ainsi peut être appliquée à l’avenir les études, de recherche sur les cellules souches et de conception des essais de thérapie génique.

Introduction

La transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est l’approche curative disponible uniquement pour une variété de désordres génétiques innées du système hématopoïétique, atteindre des taux de survie sans maladie de plus de 90 % d’ailleurs fortement compromise et durée de vie limitée patients¹. L’efficacité de cet outil thérapeutique important a été optimisée en limitant la toxicité de pré- et post transplantation schémas², mais aussi par des interventions vise à soutenir la fonction du greffon stable, qui est quantifié par un suivi étroit des cellules dérivées donneur³

Protocol

1. isolement des cellules de moelle osseuse hématopoïétique en triant les cellule activée par Fluorescence multiparamétrique

1. échantillon coloration
   1. avant de commencer le processus, les éléments suivants doivent être collectées et préparé :
      1. médias de Gradient pour la préparation de mononucléaires cellules tubes (GM), 50 mL conique
      2. 12 x 75 mm tubes de flux pour la coloration des cellules
      3. coloration tampon : tampon phosphate salin (PBS) + 3 % de sérum de veau foetal (FCS)
      4. Pipettes < / l J’ai >
      5. FC bloc et coloration des anticorps (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Avec cette combinai....

Results

Séparation des progéniteurs lymphohématopoïétiques en triant les cellules FACS

Nous démontrons ici résultats du tri des populations de cellules nécessaires pour l’analyse en aval de STR. Les cellules de la moelle osseuse ont été colorées avec V450 conjugué anti-CD45, conjugué FITC anti-CD36 et APC conjugué anti-CD34. La population visée est les mégacaryocyte progéniteurs (MEP), nucléées les cellules érythroïdes .......

Discussion

L’objectif de la présente étude est de fournir au public une combinaison des deux approches pour analyser chimérisme donneur/receveur en progéniteurs érythroïdes suite tcsh chez les patients traités pour hémoglobinopathies : 1.) activés par fluorescence cellulaire tri des cellules souches hématopoïétiques dans des échantillons de moelle osseuse suivies d’analyse de séquences répétées en tandem courtes et 2.) unité formant colonie de plus en plus de cellules de moelle osseuse, classification des colonies dans divers types.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	GE Healthcare	GE17-1440-02  ;	Supprimer les globules rouges
Tubes coniques de 50 mL	Falcon	14-432-22	Préparation d’échantillons
12 tubes d’écoulement de 75 mm	Falcon	352002	Tri FACS
Solution saline tamponnée	au phosphate Gibco	10010023	PBS
Sérum de veau fœtal	Invitrogen Inc.	16000-044	FCS (inactivé par la chaleur)
CD34 APC	BD Bioscience	561209	FACS-Ab
CD36 FITC	BD Bioscience	555454	FACS-Ab
CD45 V450	BD Bioscience	642275	FACS-Ab
Trypan blue	Gibco	15250061
Hemocytometer	Invitrogen Inc.	C10227	Comptage automatique des cellules
Hank' s Solution saline équilibrée	Gibco	14025092	Tampon de suspension dans l’analyse FACS
HEPES	Gibco 15630080		Composant du tampon de suspension
FcR	BD Bioscience	564220	Bloc FCR
FACS Aria I	BD Bioscience	23-11539-00	Trieur FACS
Recombinant  ; érythropoïétine humaine	Affimetrix eBioscience	14-8992-80	EPO
Isocove s Dulbecco modifié' s Medium	Gibco	12440053	IMDM
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081	Composant du milieu de culture
CD34+ billes magnétiques	Milteny Biotech	130-046-702	CD34+
purification Recombinant  ; humain G-CSF	Gibco	PHC2031	CFU-Assay
Recombinant  ; humain SCF	Gibco	CTP2113	CFU-Assay
Recombinant  ; humain GM-CSF	Gibco	PHC2015	CFU-Assay
Recombinant  ; humain IL-3	BD Bioscience	554604	CFU-Assay
Recombinant  ; humain IL-6	BD Bioscience Bioscience	550071	CFU-Assay
Methocult H4434	Medium Stemcell Technologies	4444	CFU-Assay
QiAmp DNA Kit d’extraction de sang	Qiagen	51306	Isolation de l’ADN
Nanodrop ND-1000 spectrale	photomètre Thermo Scientific	ND 1000	Quantification de l’ADN
DNAase libre H2O	Thermo Scientific	FEREN0521	Préparation de l’ADN
AmplTaq Gold DNA polymérase	Applied Bioscience	N8080240	PCR
Eppendorf mastercycler gradient	Eppendorf	6321000019	PCR  ;
Hi-Di Formamid	Applied Bioscience	4311320	PCR
GeneScan 500 ROX Taille standard	Applied Bioscience	4310361	PCR
3130 Analyseur génétique	Applied Bioscience	313001R	PCR