Summary

Detección de células progenitoras eritroides de donantes Residual después del trasplante de células madre hematopoyéticas para los pacientes con hemoglobinopatías

Published: September 06, 2017
doi:

Summary

Cuantificación de células procedentes de donantes es necesaria para supervisar el engraftment después del trasplante de células madre en pacientes con hemoglobinopatías. Una combinación de la clasificación de celda basados en citometría de flujo, análisis de formación de Colonia y posterior análisis de corto tándem repeticiones pueden utilizarse para evaluar la proliferación y diferenciación de progenitores en el compartimiento eritroide.

Abstract

La presencia de quimerismo incompleto se observa en una gran proporción de pacientes después de trasplante de médula ósea para la talasemia mayor o enfermedad de células falciformes. Esta observación tiene enormes consecuencias, como estrategias de inmunomodulación terapéutica posterior pueden mejorar el resultado clínico. Convencionalmente, análisis reacción-basado cadena de la polimerasa de repeticiones en tándem cortas se utiliza para identificar el quimerismo en las células sanguíneas derivadas de donantes. Sin embargo, este método está restringido a las células nucleadas y no puede distinguir entre linajes unicelular disociados. Aplicamos el análisis de repeticiones en tándem cortas de células progenitoras hematopoyéticas ordenados por citometría de flujo y esto comparado con el análisis de repeticiones en tándem cortas de ráfaga-formación seleccionada – colonias eritroides, ambos recogidos del hueso médula ósea. Con este método que son capaces de demostrar los diferentes proliferación y diferenciación de células del donante en el compartimiento eritroide. Esta técnica es elegible para completar el seguimiento actual de quimerismo en el trasplante de células madre que se ajuste y por lo tanto puede ser aplicados estudios clínicos en el futuro, la célula de vástago investigación y diseño de ensayos de terapia genética.

Introduction

Trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT) es el enfoque curativo sólo está disponible para una variedad de trastornos genéticos innatos del sistema hematopoyético, lograr tasas de supervivencia libre de enfermedad de más del 90% de lo contrario altamente comprometida y vida útil limitada de pacientes1. La eficacia de esta importante herramienta terapéutica ha sido optimizada por limitar la toxicidad de pre- y post-trasplante regímenes2, pero también por las intervenciones encaminadas a mantener la función estable del injerto, que se cuantifica por la vigilancia estrecha de células procedentes de donantes3,4,5.

En general, quimerismo completo (CC) implica la sustitución total del compartimiento del lymphohematopoietic por células derivadas del donante, mientras que el término mezclado chimerism (MC) se utiliza cuando las células derivadas del donante y del receptor están simultáneamente presentes en varios proporciones. Quimerismo dividido (SC) denota la coexistencia del chimerism mezclado observado en linajes unicelular, como en el compartimento eritroide. Determinación rápida del estado de quimerismo después de HSCT es crítica, como puede ayudar a identificar a los pacientes susceptibles de recaída de la enfermedad y estrategias de iniciar posteriores inmunomoduladores, como infusiones de linfocitos de donante o la reducción de inmunosupresores terapias6.

Varios métodos han sido desarrollados para supervisar el engraftment después de HSCT. Isotyping de las inmunoglobulinas y el análisis de citogenética tienen pobre sensibilidad y están limitados en su capacidad para detectar polimorfismo7,8. La introducción de fluorescente en situ del hibridación (pescado) puede mejorar la sensibilidad en el seguimiento de quimerismo después de HSCT, pero se limita a aloinjertos no coinciden el sexo9. Actualmente, la reacción en cadena de polimerasa (PCR) es el método más generalizado para detectar chimerism y está basada en electroforesis del gel de agarosa-acrilamida convencional de repeticiones en tándem número variable (VNTRs) o repeticiones de corto tándem (STRs). Rutinariamente utilizado PCR cuantitativa es capaz de detectar una proporción muy pequeña de células de donantes residual después de HSCT. La limitación principal de los estudios hasta ahora es que MC detección se limita casi exclusivamente a la presencia de células nucleadas, en lugar de eritrocitos maduros, es decir, las células funcionalmente crucial para los pacientes afectado por hemoglobinopatías. En pacientes con grupos sanguíneos diferentes, cabe recordar que el análisis de cytofluorometric es capaz de identificar el quimerismo de células de sangre rojas mediante la utilización de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia los antígenos de eritrocitos ABO y C, c, D, E y e10 , 11. un medio diferente, pero muy interesante de evaluación de quimerismo en el linaje eritroide es la combinación de flujo cytometric selección de progenitores eritroides y selección de diversos tipos de progenitoras eritroides por cultivo en análisis clonogenic, seguido por el análisis de STR12. Este enfoque es capaz de cuantificar las proporciones relativas de quimerismo de donante y receptor en el compartimiento eritroide y puede ser utilizado en la estrategia para sostener el injerto de médula ósea.

Protocol

1. aislamiento de células hematopoyéticas de la médula ósea por clasificación de células activado por fluorescencia multiparámetro muestra tinción antes de iniciar el proceso, los siguientes elementos deben ser recogidos y preparados: medios de gradiente para la preparación de mononucleares células tubos (GM), cónico 50 mL tubos de flujo de 12 x 75 mm para la tinción de las células tampón de tinción: tampón de fosfato salino (PBS) + 3% de suero…

Representative Results

Separación de progenitores lymphohematopoietic por clasificación de celular FACS Aquí demostramos resultados de clasificación de las poblaciones celulares necesarios para posteriores análisis de STR. Células de médula ósea fueron manchadas con V450 conjugado anti-CD45 FITC conjugado anti-CD36 y conjugado con APC anti-CD34. La población de interés es de las megacariocitos progenitores (MEP), nucleadas l…

Discussion

El objetivo del actual estudio es proporcionar al público una combinación de dos enfoques para el análisis de quimerismo donante/receptor en progenitores eritroides después de HSCT en pacientes trataron por Hemoglobinopatías: 1.) clasificación celular activado por fluorescencia de células progenitoras hematopoyéticas en muestras de médula ósea seguidas de análisis de repeticiones en tándem cortas y 2.) Unidad Formadora de colonias de crecimiento de las células de la médula ósea, clasificación de las colon…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Kinderkrebshilfe arco iris Südtirol.

Materials

Ficoll-Paque GE Healthcare GE17-1440-02  Remove RBC
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22 Sample preparation
12 x 75 mm flow tubes Falcon 352002 FACS sorting
Phosphate buffered saline Gibco 10010023 PBS
Fetal calf serum Invitrogen Inc. 16000-044 FCS (heat-inactivated)
CD34 APC BD Bioscience 561209 FACS-Ab
CD36 FITC BD Bioscience 555454 FACS-Ab
CD45 V450 BD Bioscience 642275 FACS-Ab
Trypan blue Gibco 15250061
Hemocytometer Invitrogen Inc. C10227 Automatic cell counting
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025092 Suspension buffer in FACS analysis
HEPES Gibco 15630080 Component of suspension buffer
FcR BD Bioscience 564220 Block FCR
FACS Aria I BD Bioscience 23-11539-00 FACS Sorter
Recombinant  human erythropoietin Affimetrix eBioscience 14-8992-80 EPO
Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium Gibco 12440053 IMDM
L-Glutamine Invitrogen 25030-081 Component of Culture Medium
CD34+ magnetic beads Milteny Biotech 130-046-702 CD34+ purification
Recombinant  human G-CSF Gibco PHC2031 CFU-Assay
Recombinant  human SCF Gibco CTP2113 CFU-Assay
Recombinant  human GM-CSF Gibco PHC2015 CFU-Assay
Recombinant  human IL-3 BD Bioscience 554604 CFU-Assay
Recombinant  human IL-6 BD Bioscience 550071 CFU-Assay
Methocult H4434 Medium Stemcell Technologies 4444 CFU-Assay
QiAmp DNA Blood extraction kit Qiagen 51306 DNA Isolation
Nanodrop ND-1000 spectra photometer Thermo Scientific ND 1000 DNA Quantification
DNAase free H2O Thermo Scientific FEREN0521 DNA Preparation
AmplTaq Gold DNA Polymerase Applied Bioscience N8080240 PCR
Eppendorf mastercycler gradient Eppendorf 6321000019 PCR 
Hi-Di Formamid Applied Bioscience 4311320 PCR
GeneScan 500 ROX Size Standard Applied Bioscience 4310361 PCR
3130 Genetic Analyzer Applied Bioscience 313001R PCR

References

  1. Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
  2. Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
  3. Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
  4. Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
  5. Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
  6. Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
  7. Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
  8. McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
  9. Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
  10. Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
  11. Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
  12. Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
  13. Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
  14. Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
  15. Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).

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Citer Cet Article
Crazzolara, R., Kropshofer, G., Steurer, M., Sopper, S., Schwinger, W. Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies. J. Vis. Exp. (127), e56002, doi:10.3791/56002 (2017).

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