Summary

النمذجة سمية اميلويد-β42 ونيوروديجينيريشن في المخ الزرد الكبار

Published: October 25, 2017
doi:

Summary

ويصف هذا البروتوكول التوليف، وتوصيف، وحقن من الببتيدات β42 اميلويد أحادي لتوليد سمية اميلويد في الزرد الكبار وضع نموذج مرض الزهايمر، تليها تحليلات غذائها والكشف عن التجميعات.

Abstract

مرض الزهايمر (ميلادي) هو المنهكة المرض الأعصاب التي تراكم السامة اميلويد-β42 الببتيدات (Aβ42) يؤدي إلى انحطاط متشابك، التهاب، موت الخلايا العصبية، وتعلم العجز. البشر لا يمكن تجديد الخلايا العصبية المفقودة في حالة الإعلان جزئيا بسبب ضعف القدرات التكاثري للخلايا الجذعية العصبية/السلف (نسبكس) والخلايا تخفيض. ولذلك، ينبغي أيضا أن يعزز كفاءة العلاجات التجدد الانتشار وقدرة العصبية نسبكس. الزرد (دانيو rerio) كائن التجدد، ويمكننا أن نتعلم البرامج الجزيئية الأساسية التي يمكن أن نصمم النهج العلاجي للتصدي للإعلانات. ولهذا السبب، من الضروري توليد نموذج مثل الإعلان في الزرد. استخدام منهجيتنا، يمكننا إدخال المشتقات الاصطناعية من الببتيد Aβ42 مع القدرة على اختراق أنسجة الدماغ الزرد الكبار، وتحليلها باثولوجيا المرض والاستجابة التجدد. ميزة على الطرق القائمة أو نماذج حيوانية الزرد تلك يمكن أن تعلمنا كيف يمكن بطبيعة الحال تجديد دماغ فقاريات، ومما يساعدنا على علاج أمراض الأعصاب البشرية أفضل من خلال استهداف نسبكس الذاتية. ولذلك، طراز اميلويد-سمية في الدماغ الزرد الكبار قد فتح آفاقاً جديدة للبحث في مجال علم الأعصاب والطب السريري. بالإضافة إلى ذلك، يسمح تنفيذ هذا الأسلوب بسيطة لتقييم تجريبية فعالة من حيث التكلفة والكفاءة. ويصف هذه المخطوطة التوليف وحقن من الببتيدات Aβ42 في الدماغ الزرد.

Introduction

الإعلان هو مرض مزمن تدريجي تتسم بفقدان الخلايا العصبية وسينابسيس في قشرة الدماغ1،2،3،،من45. بصمات لاثيل الكلاسيكي للإعلان هي ترسب الببتيدات اميلويد والتشابك تشكيل نيوروفيبريلاري (NFTs)6. خرف لويحات، يعرف أيضا باسم لويحات اميلويد، تتألف من الببتيدات اميلويد-بيتا (Aβ) التي تشكل هياكل الطيات بيتا في الدماغ حمة5. تراكم Aβ42 في المرضى الإعلانية دور مبكر وحاسم في تطور المرض. إعلان يطلق سلسلة أحداث التي أدت إلى خلل متشابك اللدونة البصر وفقدان الخلايا العصبية7،8،،من910.

الدماغ الكبار من الزرد تيليوست بمثابة نموذجا ممتازا لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية اللدونة11،،من1213،،من1415، 16،،من1718،،من1920 والأمراض المختلفة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، بما في ذلك الإعلان21،22،23 ،24. ونظرا لمجموعة واسعة من الأساليب التجريبية المتاحة19،،من2025،26،27،،من2829، 30 , 31، من هذه الدراسات مفيدة ومجدية. ويمكن تجديد الزرد الجهاز العصبي المركزي13،15،32،،من3334،35،36،37، 38، في جزء منه باستخدام البرامج الجزيئية تفعيلها بعد فقدان الخلايا العصبية19،39،،من4041،،من4243، 44. ولذلك يمكن أن يساعد وضع نموذج مرض الأعصاب في الزرد عنوان رواية أسئلة بشأن التجدد البيولوجيا القدرة، والخلايا الجذعية في أدمغة الفقاريات.

في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير نموذج سمية اميلويد في الدماغ الزرد الكبار عن طريق حقن الاصطناعية Aβ42 الببتيدات (الجدول 1)39. تسبب هذه الحقن تعمل نيوروديجينيريشن يذكرنا بأمراض المخ البشري (مثلموت الخلية، التنشيط ميكروجليال، وانحطاط متشابك والعجز في الذاكرة)، مما يشير إلى أن الزرد يمكن استخدامها للحصول على نيوروديجينيريشن في المخ الزرد، حددت Aβ42 يمكن اكتشاف الببتيدات مع ستاينينجس المناعي، والآليات الجزيئية للتجدد في الزرد البالغين يمكن أن يكون الجهاز العصبي المركزي39. في هذا البروتوكول، ونظهر حقن الببتيدات اميلويد الاصطناعية في الدماغ الزرد استخدام سيريبروفينتريكولار حقن (كفمي) أسلوب27،39،،من4546 لتقليد ترسب اميلويد (الشكل 1). كفمي يوفر طريقة جديدة لإيصال الببتيدات، تجميع عند الحقن كهياكل β-ورقة وممارسة السمية. الببتيدات توزع بالتساوي في جميع أنحاء الدماغ، واستهداف منطقة البطين على طول محور rostro والذيلية كامل45. بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب لتحليل استجابة الجزيئية والمورفولوجية نسبكس في المخ الزرد الكبار عقب تضمينات اميلويد. هذه الدراسات سوف يتيح لنا نظرة ثاقبة لإصلاح الدماغ الناجح في الثدييات. يمكن استخدام لدينا طريقة لفهم إليه استجابة التجديد الناجح الجزيئية الضرورية بعد الإعلان تشبه أعراض للحث على تجديد الخلايا العصبية المفقودة واستعادة الوظيفية.

Protocol

هذا البروتوكول إجراء موحد اقترح المبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي (2010/63) و “الجمعية الأوروبية” “نماذج الأسماك” في علم الأحياء والطب (يوفيشبيوميد) في كارلسروه معهد للتكنولوجيا (مجموعة). جميع الأساليب الموصوفة هنا بعد موافقة لجنة الأخلاقيات (درسدن لانديسديريكشن؛ والوثيقة رقم تفف-52/2015)- <p c…

Representative Results

[هبلك] كان يستخدم لتنقية الببتيد المركب وقد استخدمت الكتلي لتوصيف الببتيدات المنقي بيتا اميلويد. كانت ساخنة العمود [هبلك] إلى 50 درجة مئوية لتحسين فصل الببتيدات Aβ وجمعت جميع الكسور. تحديد الببتيد مركباً بشكل صحيح، أجرى التحليل الطيفي الشامل لجميع الكسور. تشروماتوجرام أوب…

Discussion

يمكن تعديل الببتيدات اميلويد لتشمل الاختلافات تسلسل أو العلامات المختلفة. على سبيل المثال، يمكن أن تتولد من ببتيد اميلويد مجمعة، ويمكن المسمى بواسطة العلامات الفلورية في ن-المحطة نهاية الببتيد الببتيدات أو معلم مع الناقل الببتيدات39. وبالمثل، هو الببتيد الناقل في هذا البروت…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ودعمت هذا العمل دزني ورابطة هلمهولتز (VH-الحرس الوطني-1021)، الاتفاقية، تو درسدن (FZ-111، 043_261518)، و DFG (KI1524/6) (كورونا)؛ ومن رابطة لايبنتز (شهد-2011-الحكومي-2) والألمانية (بيوليثومورفي 03Z2E512) (Y.Z.). كما نود أن نشكر اولريكي هوفمان لتوليف الببتيد، و Asokan نانديني وبريج موراوالا تاناكا اللي للحصول على مساعدة أثناء تصوير هذا الإجراء.

Materials

Fmoc-protected amino acids IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1030 Activator
Oxyma IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1180 Racemization supressor
N,N-Diisopropylethylamine IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-003 Base
Dimethylformamide IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-004 Solvent
N-Methylmorpholine Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany A12158 Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) 157260 ALDRICH Activator
Piperidine MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 822299 Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 106050 Solvent
Formic acid (FA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 100264 Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 808260 Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 233781 ALDRICH Clevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH 34967-1L Solvent
Acetonitrile (for HPLC) VWR International Ltd, England 83639.320 Solvent
Diethylether VWR International Ltd, England 23811.326 Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT) VWR International Ltd, England 0281-25G Clevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) S30023 Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters Intavis AG (Cologne, Germany) 34.274 Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 11806-50-N Filteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe KC78.1 Pre-filteration for HPLC
Peptide Synthesizer Intavis, Cologne, Germany ResPep SL Automated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLC Waters, Milford Massachusetts, USA Waters 2998, Waters e2695 Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm Phenomenex Ltd. Germany 00G-4328-N0 Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA LCPAK0001 Water purification system
Filtration Unit Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 16307 Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV Detector Waters, Milford Massachusetts, USA M09UPA 664M Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm Waters, Milford Massachusetts, USA 186002350 Analytical C18 column
ACQUITY TQ Detector Waters, Milford Massachusetts, USA QBB908 Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany 16706, 101542 Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate reader Beckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040
Petri dishes Sarstedt 821.472
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056
Needle Becton-Dickinson 305178
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10
PicoNozzle World Precision Instruments 5430-12
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG
Cryostat Leica CM1950

References

  1. LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer’s disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
  3. Serpell, L. C. Alzheimer’s amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
  4. Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer’s disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
  5. Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer’s disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
  6. Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer’s disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
  7. Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer’s disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
  8. McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  9. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  10. Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer’s disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
  11. Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
  12. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
  13. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  14. Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
  15. Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
  16. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  17. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
  18. Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  19. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  20. Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
  21. Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer’s disease?. Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
  22. Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer’s disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
  23. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  24. Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
  25. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  26. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  27. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
  28. Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
  29. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  30. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
  31. Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
  32. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
  33. Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
  34. Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  35. Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
  36. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  37. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
  38. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  39. Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
  40. Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
  41. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
  42. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  43. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  44. Katz, S., et al. . Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
  45. Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
  46. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
  47. Sewald, N., Jakubke, H. . Peptides: Chemistry and Biology. , (2009).
  48. Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chimie. 22 (25), 8685-8693 (2016).
  49. Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
  50. Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
  51. Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
  52. Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).

Play Video

Citer Cet Article
Bhattarai, P., Thomas, A. K., Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Mashkaryan, V., Zhang, Y., Kizil, C. Modeling Amyloid-β42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (128), e56014, doi:10.3791/56014 (2017).

View Video