Summary

Modélisation de toxicité amyloïde-β42 et neurodégénérescence dans le cerveau de poisson-zèbre adulte

Published: October 25, 2017
doi:

Summary

Ce protocole décrit la synthèse, la caractérisation et injection de peptides de monomère amyloïde-β42 pour générer les toxicité amyloïde dans adult poisson zèbre à établir un modèle de la maladie d’Alzheimer, suivi d’analyses histologiques et détection de agrégations.

Abstract

La maladie d’Alzheimer (ma) est une maladie neurodégénérative quelle accumulation d’amyloïde toxique-β42 des peptides (Aβ42) mène à la dégénérescence synaptique, l’inflammation, la mort neuronale débilitante et déficits d’apprentissage. Les humains ne peut pas régénérer les neurones perdus dans le cas de l’AD en partie en raison de la capacité de prolifération réduite des cellules souches/progénitrices neurales (NSPC) et réduit la neurogenèse. Par conséquent, thérapies régénératives efficaces devraient également accroître la prolifération et neurogène de NSPC. Zebrafish (Danio rerio) est un organisme régénératrice, et nous pouvons apprendre les programmes moléculaires fondamentales avec laquelle nous pourrions concevoir approches thérapeutiques pour lutter contre les AD. Pour cette raison, la génération d’un modèle AD-comme chez le poisson zèbre était nécessaire. En utilisant notre méthodologie, nous pouvons introduire synthétiques dérivés du peptide Aβ42 avec capacité de pénétration tissulaire dans le cerveau adulte poisson-zèbre et analyser la pathologie de la maladie et la réponse régénératrice. L’avantage sur les méthodes existantes ou des modèles animaux est que ce poisson zèbre peut nous apprendre comment un cerveau vertébré peut régénérer naturellement et ainsi nous aider à traiter les maladies neurodégénératives humaines mieux en ciblant les NSPC endogène. Par conséquent, le modèle amyloïde-toxicité dans le cerveau du poisson-zèbre adulte peut ouvrir de nouvelles avenues pour la recherche dans le domaine des neurosciences et de la médecine clinique. En outre, l’exécution simple de cette méthode permet d’évaluation expérimentale rentable et efficace. Ce manuscrit décrit la synthèse et l’injection de peptides Aβ42 dans le cerveau du poisson-zèbre.

Introduction

AD est une maladie chronique caractérisée par la perte des neurones et de synapses dans le cortex cérébral1,2,3,4,5. Les caractéristiques neuropathologiques de la maladie classiques de publicité sont les dépôts de peptides amyloïdes et formation de la neurofibrillaire embrouillent (NFTs)6. Les plaques séniles, également connu sous le nom de plaques amyloïdes, sont composés de peptides amyloïdes-β (Aβ) qui forment des structures β-plissées dans le parenchyme de cerveau5. L’accumulation de Aβ42 dans Alzheimer joue un rôle critique et début dans la progression de la maladie. AD déclenche une cascade d’événements conduisant à la dysfonction synaptique, plasticité avec facultés affaiblies et perte neuronale7,8,9,10.

Le cerveau adulte des téléostéens poisson zèbre sert un excellent modèle pour étudier la régulation de la plasticité des cellules souches11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 et diverses maladies dans le système nerveux central (CNS), y compris AD21,22,23 ,,24. Grâce à une vaste gamme de méthodes expérimentales disponibles19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, ces études sont informatifs et réalisable. Poisson zèbre peut reconstituer le CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, en partie à l’aide de programmes moléculaires activés après la perte neuronale19,39,40,41,42,43, 44. Par conséquent, établissant un modèle de maladie neurodégénérative chez le poisson zèbre peut aider à poser des questions nouvelles concernant la biologie régénératrice de capacité et de cellules souches dans les cerveaux vertébrés.

Récemment, nous avons développé un modèle de toxicité amyloïde dans le cerveau du poisson-zèbre adulte en injectant synthétique Aβ42 peptides (tableau 1)39. Cette injection causé des phénotypes de neurodégénérescence réminiscent de la pathologie du cerveau humain (p. ex., la mort cellulaire, activation microgliale, dégénérescence synaptique et les déficits de mémoire), indiquant que poisson zèbre peut être utilisée pour susciter neurodégénérescence dans le cerveau du poisson-zèbre, Aβ42 peptides peuvent être détectées avec salissures immunohistochimiques et mécanismes moléculaires de la régénération chez le poisson zèbre adulte, que CNS peut être identifié39. Dans ce protocole, nous démontrons l’injection de synthétiques peptides amyloïdes dans le cerveau de poisson-zèbre à l’aide d’un cérébroventriculaire injection (CVMI) méthode27,39,45,46 pour imiter le dépôt amyloïde (Figure 1). CVMI propose une nouvelle façon d’offrir les peptides, qui agrègent à injection en tant que structures feuillet β et exercer une toxicité. Les peptides sont réparties uniformément dans tout le cerveau, en ciblant la zone ventriculaire le long de l’ axe rostro-caudal ensemble45. En outre, cette méthode permet pour analyser la réponse morphologique et moléculaire de la NSPC dans le cerveau adulte poisson zèbre suite des inclusions amyloïdes. Ces études nous donnera un aperçu de la réparation du cerveau réussie chez les mammifères. Notre méthode peut être utilisée pour comprendre le mécanisme moléculaire nécessaire d’une réponse de régénération réussie après AD-comme des symptômes d’induire la reconstitution des neurones perdus et la récupération fonctionnelle.

Protocol

ce protocole est une procédure standard proposée par les orientations de l’UE (2010/63) et la société européenne pour les modèles de poissons en biologie et en médecine (EuFishBioMed) à Karlsruhe Institut de technologie (KIT). Toutes les méthodes décrites après ici ont été approuvés par la commission d’éthique (Landesdirektion Dresden ; le numéro TVV-52/2015). 1. préparation du Peptide Aβ42 synthétiser des peptides (voir tableau 1) en utilis…

Representative Results

HPLC servait à purifier le peptide synthétisé et spectrométrie de masse a été utilisée pour caractériser les peptides purifié β-amyloïde. La colonne HPLC a été chauffée à 50 ° C afin d’améliorer la séparation des peptides bêta-amyloïdes, et toutes les fractions ont été recueillies. Pour identifier le peptide synthétisé correctement, analyse de spectrométrie de masse a été réalisée pour toutes les fractions. Le chromatogramme UPLC montre la pureté du compos?…

Discussion

Les peptides amyloïdes peuvent être modifiés pour inclure les variations de séquence ou les différentes balises. Par exemple, un peptide bêta-amyloïde brouillé peut être généré, et les peptides peuvent être marqués avec des étiquettes fluorescentes à la N-terminale de la fin de peptide ou transporteur peptides39le tag. De même, dans le présent protocole, le peptide de transporteur est la pénétration cellulaire peptide TR en raison de son efficacité pour transport marchandise p…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le DZNE et l’Association Helmholtz (VH-NG-1021), CRDT, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) et Dia (KI1524/6) (C.K.) ; et par la Communauté Leibniz (scie-2011-gif-2) et le BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Nous tenons également à remercier Ulrike Hofmann pour la synthèse de peptide et à Nandini Asokan et Prayag Murawala Elly Tanaka pour aide pendant le tournage de la procédure.

Materials

Fmoc-protected amino acids IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1030 Activator
Oxyma IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1180 Racemization supressor
N,N-Diisopropylethylamine IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-003 Base
Dimethylformamide IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-004 Solvent
N-Methylmorpholine Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany A12158 Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) 157260 ALDRICH Activator
Piperidine MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 822299 Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 106050 Solvent
Formic acid (FA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 100264 Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 808260 Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 233781 ALDRICH Clevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH 34967-1L Solvent
Acetonitrile (for HPLC) VWR International Ltd, England 83639.320 Solvent
Diethylether VWR International Ltd, England 23811.326 Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT) VWR International Ltd, England 0281-25G Clevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) S30023 Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters Intavis AG (Cologne, Germany) 34.274 Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 11806-50-N Filteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe KC78.1 Pre-filteration for HPLC
Peptide Synthesizer Intavis, Cologne, Germany ResPep SL Automated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLC Waters, Milford Massachusetts, USA Waters 2998, Waters e2695 Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm Phenomenex Ltd. Germany 00G-4328-N0 Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA LCPAK0001 Water purification system
Filtration Unit Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 16307 Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV Detector Waters, Milford Massachusetts, USA M09UPA 664M Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm Waters, Milford Massachusetts, USA 186002350 Analytical C18 column
ACQUITY TQ Detector Waters, Milford Massachusetts, USA QBB908 Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany 16706, 101542 Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate reader Beckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040
Petri dishes Sarstedt 821.472
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056
Needle Becton-Dickinson 305178
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10
PicoNozzle World Precision Instruments 5430-12
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG
Cryostat Leica CM1950

References

  1. LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer’s disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
  3. Serpell, L. C. Alzheimer’s amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
  4. Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer’s disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
  5. Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer’s disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
  6. Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer’s disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
  7. Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer’s disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
  8. McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  9. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  10. Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer’s disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
  11. Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
  12. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
  13. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  14. Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
  15. Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
  16. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  17. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
  18. Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  19. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  20. Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
  21. Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer’s disease?. Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
  22. Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer’s disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
  23. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  24. Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
  25. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  26. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  27. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
  28. Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
  29. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  30. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
  31. Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
  32. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
  33. Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
  34. Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  35. Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
  36. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  37. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
  38. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  39. Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
  40. Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
  41. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
  42. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  43. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  44. Katz, S., et al. . Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
  45. Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
  46. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
  47. Sewald, N., Jakubke, H. . Peptides: Chemistry and Biology. , (2009).
  48. Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chimie. 22 (25), 8685-8693 (2016).
  49. Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
  50. Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
  51. Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
  52. Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).

Play Video

Citer Cet Article
Bhattarai, P., Thomas, A. K., Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Mashkaryan, V., Zhang, Y., Kizil, C. Modeling Amyloid-β42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (128), e56014, doi:10.3791/56014 (2017).

View Video