चूहों और उनके Hippocampi के अंश में Electroconvulsive बरामदगी Postsynaptic घनत्व प्रोटीन में जब्ती प्रेरित परिवर्तन की जांच करने के लिए
Summary
Electroconvulsive जब्ती (ईसीएस) गंभीर अवसाद के लिए Electroconvulsive चिकित्सा का एक प्रायोगिक पशु मॉडल है । ईसीएस वैश्विक रूप से हिप्पोकैंपस में गतिविधि को उत्तेजित करता है, synaptogenesis और synaptic प्लास्टिक के लिए अग्रणी । यहां, हम चूहों में ईसीएस प्रेरण के लिए तरीकों का वर्णन और उनके hippocampi के सेलुलर अंश के लिए synaptic प्रोटीन में जब्ती प्रेरित परिवर्तन की जांच ।
Abstract
Electroconvulsive जब्ती (ईसीएस) Electroconvulsive चिकित्सा, गंभीर अवसाद के लिए सबसे प्रभावी उपचार का एक प्रायोगिक पशु मॉडल है । ईसीएस कम मृत्यु दर और न्यूरॉन की मौत के साथ सामान्यीकृत टॉनिक-क्लोनल बरामदगी और विरोधी मिरगी दवाओं स्क्रीन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल है लाती है । यहां, हम एक ईसीएस प्रेरण विधि का वर्णन जिसमें एक संक्षिप्त ५५-mA वर्तमान ०.५ एस के लिए पुरुष चूहों २००-२५० जी के लिए वजन में कान क्लिप इलेक्ट्रोड के माध्यम से दिया है । इस तरह के द्विपक्षीय उत्तेजना चरण 4-5 क्लोनल बरामदगी है कि के बारे में पिछले 10 एस का उत्पादन किया । तीव्र या जीर्ण ईसीएस की समाप्ति के बाद, ज्यादातर चूहों को शर्मसार “नहीं जब्ती” चूहों से व्यवहार से अलग हो बरामद किया । क्योंकि ईसीएस दुनिया भर में मस्तिष्क गतिविधि तरक्की, यह भी synaptic प्रोटीन की गतिविधि पर निर्भर परिवर्तन और synaptic शक्ति कई तरीकों का उपयोग कर अपने प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । विशेष रूप से, postsynaptic घनत्व के उपसेलुलर भिन्नीकरण (PSD) पश्चिमी सोख्ता के साथ संयोजन में इस विशेष synaptic संरचना में synaptic प्रोटीन की बहुतायत के मात्रात्मक निर्धारण के लिए अनुमति देता है. एक पिछले अंश विधि है कि कुतर दिमाग की बड़ी राशि की आवश्यकता के विपरीत, हम यहां का वर्णन एक छोटे पैमाने पर भिन्नीकरण विधि एक एकल चूहे के hippocampi से PSD को अलग करने के लिए, सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक के बिना । इस विधि का प्रयोग, हम बताते है कि अलग PSD अंश postsynaptic झिल्ली प्रोटीन, PSD95, GluN2B, और GluA2 सहित शामिल हैं । Presynaptic मार्कर synaptophysin और घुलनशील cytoplasmic प्रोटीन α-tubulin psd अंश से बाहर रखा गया था, सफल psd अलगाव का प्रदर्शन । इसके अलावा, पुरानी ईसीएस psd में GluN2B अभिव्यक्ति की कमी हुई, यह दर्शाता है कि हमारे छोटे पैमाने psd भिन्नीकरण विधि आनुवंशिक, औषधीय, या यांत्रिक उपचार के बाद एक भी चूहे से हिप्पोकैम्पस PSD प्रोटीन में परिवर्तन का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता .
Introduction
Electroconvulsive चिकित्सा गंभीर दवा प्रतिरोधी अवसाद, द्विध्रुवी अवसाद, पार्किंसंस रोग, और एक प्रकार का पागलपन1,2सहित प्रमुख अवसादग्रस्तता विकारों के साथ रोगियों का इलाज करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस चिकित्सा में, जब्ती विद्युत उत्तेजना epicranial इलेक्ट्रोड के माध्यम से anesthetized रोगियों के सिर को दिया द्वारा उत्पन्न होता है1,2,3. ईसीएस के दोहराव प्रशासन चिकित्सकीय दवा प्रतिरोधी अवसादग्रस्तता विकारों के लिए फायदेमंद रहा है1,2,3। हालांकि, मानव में एंटी इफेक्ट की दीर्घकालिक प्रभावकारिता अंतर्निहित सटीक तंत्र मायावी बनी हुई है । ईसीएस electroconvulsive थेरेपी का एक पशु मॉडल है और इसकी चिकित्सीय व्यवस्था की जांच के लिए व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है । कुतर में, दोनों तीव्र ईसीएस और जीर्ण ईसीएस उपचार hippocampi में वयस्क neurogenesis को बढ़ावा देने और तंत्रिका नेटवर्क को पुनर्गठित4,5, जो संज्ञानात्मक लचीलेपन में सुधार करने के लिए योगदान करने की संभावना है । इसके अलावा, ईसीएस द्वारा मस्तिष्क गतिविधि के वैश्विक उन्नयन इस तरह के एक मस्तिष्क व्युत्पंन neurotropic कारक के रूप में टेप की बहुतायत बदल जाता है6, और metabotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर 17 और एन मिथाइल-डी-aspartate सहित कई प्रोटीन, (एनएमडीए) प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर7यूनिटों । इन परिवर्तनों को हिप्पोकैंपस में synapse संख्या, संरचना, और शक्ति की लंबी अवधि के संशोधन मध्यस्थता में शामिल कर रहे हैं7,8,9।
ईसीएस मॉडल में, बिजली की उत्तेजना stereotaxically प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड, corneal इलेक्ट्रोड, या कान इलेक्ट्रोड के माध्यम से कुतर दिया है सामान्यीकृत टॉनिक-क्लोनल बरामदगी10,11पैदा करने के लिए । इलेक्ट्रोड के Stereotaxic आरोपण मस्तिष्क शल्य चिकित्सा शामिल है और चोट को कम करने के लिए प्रयोगकर्ता शल्य चिकित्सा कौशल में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण समय की आवश्यकता है । कम इनवेसिव corneal इलेक्ट्रोड corneal घर्षण और सूखापन पैदा कर सकता है और संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है । कान क्लिप इलेक्ट्रोड का उपयोग इन सीमाओं को दरकिनार क्योंकि वे सर्जरी या संज्ञाहरण के बिना कुतर पर इस्तेमाल किया जा सकता है और न्यूनतम चोट का कारण । दरअसल, हमने पाया है कि वर्तमान कान क्लिप इलेक्ट्रोड के माध्यम से जाग चूहों को दिया मज़बूती से स्टेज 4-5 टॉनिक-क्लोनिंग बरामदगी और उनके hippocampi10में synaptic प्रोटीन बदल जाता है ।
synaptic प्रोटीन के विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में ईसीएस प्रेरित बहुतायत की जांच करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है प्रयोगात्मक तरीकों कि उनके पता लगाने और ठहराव के लिए सबसे उपयुक्त है का चयन करने के लिए । मस्तिष्क की सेल् फी घुलनशील cytosolic प्रोटीन के क्रूड अलगाव के लिए अनुमति देता है; झिल्ली प्रोटीन; organelle-सीमा प्रोटीन; और भी विशेष उपसेलुलर संरचनाओं में प्रोटीन, जैसे PSD12,13,14। PSD एक घने और अच्छी तरह का आयोजन किया है, जिसमें synaptic प्रोटीन अत्यधिक और postsynaptic झिल्ली के पास पर केंद्रित कर रहे है ंयूरॉंस में सेलुलर डोमेन12,13,15। psd के अलगाव synaptic प्रोटीन के अध्ययन के लिए उपयोगी psd पर समृद्ध है, बहुतायत और postsynaptic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स, मचान प्रोटीन के समारोह में गतिशील परिवर्तन के बाद से, और संकेत transduction प्रोटीन में12 psd , 15 , 16 , 17 synaptic प्लास्टिक और synaptopathy कई स्नायविक विकारों17,18में मनाया के साथ संबंधित हैं । एक पिछले उपसेलुलर अंश विधि सुक्रोज ढाल14के अंतर केंद्रापसारक द्वारा मस्तिष्क के कच्चे झिल्ली अंश से डिटर्जेंट-अघुलनशील अंश के अलगाव शामिल PSD को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया, 19. इस पारंपरिक विधि के साथ प्रमुख चुनौती यह है कि इसे कुतर दिमाग की बड़ी मात्रा14,19की आवश्यकता है । 10-20 कुतर के उपचार प्रति PSD अंश को अलग करने की तैयारी व्यापक लागत और समय निवेश की आवश्यकता है और व्यावहारिक रूप से संभव नहीं है अगर वहां कई उपचार कर रहे हैं ।
इस चुनौती को दूर करने के लिए, हम एक सरल तरीका है कि सीधे psd अंश को अलग अनुकूलित किया है, सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक20,21के बिना, और यह संशोधित करने के लिए एक ही चूहे की hippocampi से psd अलगाव लागू हो मस्तिष्क. हमारे छोटे पैमाने psd अंश विधि 2 hippocampi से psd प्रोटीन के 30-50 µ जी के बारे में पैदावार, कई जैव रासायनिक परख में उपयोग के लिए पर्याप्त immunoprecipitation और पश्चिमी सोख्ता सहित, । पश्चिमी सोख्ता postsynaptic घनत्व प्रोटीन ९५ (psd-९५) और presynaptic मार्कर synaptophysin और घुलनशील cytoplasmic प्रोटीन α-tubulin के बहिष्कार के संवर्धन खुलासा द्वारा PSD अलग करने के लिए हमारी विधि की सफलता दर्शाता है । हमारे ईसीएस प्रेरण और छोटे पैमाने psd भिन्नीकरण तरीकों आसानी से अन्य कुतर मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए अनुकूलनीय हैं और PSD प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर ईसीएस के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और विश्वसनीय तरीका प्रदान करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम चूहों में एक ईसीएस प्रेरण पद्धति का वर्णन है कि उनके hippocampi में न्यूरॉन गतिविधि के वैश्विक उत्तेजना बटोरता है । ईसीएस electroconvulsive थेरेपी के एक पशु मॉडल है, जो नैदानिक मानव में दवा दुर्दम्य अवसादग्रस्त?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक हमें अंश के लिए अपने केंद्रापसारक का उपयोग करने की अनुमति के लिए डॉ एरिक सी बोल्तों धंयवाद और डॉ ग्राहम एच Diering है जॉन हॉपकिंस विश्वविद्यालय में डॉ रिचर्ड एल Huganir लैब में हमें छोटे पैमाने पर प्रोटोकॉल के साथ प्रदान करने के लिए PSD अंश के लिए ।
Materials
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
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