Intrasplenic transplantatie van hepatocyten na gedeeltelijke Hepatectomy in KNIPOOG. SCID muizen
Summary
We hebben een protocol voor het uitvoeren van gedeeltelijke hepatectomy (PHx) en cel transplantatie via milt in KNIPOOG beschreven. SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/j) muizen. In dit protocol wordt een incisie gemaakt bloot en resect de linker kwab van de lever, gevolgd door een andere snede voor intrasplenic transplantatie van cellen.
Abstract
Gedeeltelijke hepatectomy is een veelzijdig en reproduceerbare methode lever regeneratie en het effect van cellen gebaseerde therapeutics in verscheidene pathologische condities te studeren. Gedeeltelijke hepatectomy vergemakkelijkt ook de verhoogde engraftment en de verspreiding van getransplanteerde cellen door versnelde neovascularization en cel migratie naar de lever. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het uitvoeren van 30% hepatectomy en transplantatie van cellen in de milt van een nietzwaarlijvige diabetische/ernstige gecombineerde immunodeficiëntie knik. SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/j) muis.
In deze procedure zijn twee kleine incisies gemaakt. De eerste incisie wordt bloot en resect de linker kwab van de lever, en een andere kleine incisie wordt gemaakt om de milt voor de intrasplenic transplantatie van cellen bloot te stellen. Deze procedure is niet vereist geen gespecialiseerde chirurgische vaardigheden en deze kan worden voltooid in 5-7 minuten met minder stress en pijn, sneller herstel en beter overleven. We hebben aangetoond dat de transplantatie van hepatocyten geïsoleerd van een groen fluorescente proteïne (GFP) uiting van de muis (transgene C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), evenals de hepatocyte als cellen van menselijke oorsprong (NeoHep) in gedeeltelijk hepatectomized knik. SCID muizen.
Introduction
Op dit moment wordt hepatocyte transplantatie voorgesteld als een alternatief voor hele orgaantransplantatie voor behandelen patiënten met ernstige leveraandoeningen. Het is van mening dat patiënten op hele orgaantransplantatie1kan overbruggen. Naast de allogene hepatocyten2, worden xenogene hepatocyten3 en hepatocyten afgeleid van stamcellen4 ook onderzocht in diermodellen. In deze context, de homing en engraftment is potentieel van de getransplanteerde cellen in de ontvanger een belangrijk criterium voor celtherapie gebaseerd in acute hepatische insufficiëntie (AHF).
Voor het onderzoeken van de transplantatie van hepatocyten of hepatocyte-achtige cellen5, is AHF gemaakt in een diermodel door chirurgische6 of farmacologische7 procedures, gevolgd door het transplanteren van de cellen. Te maken van een dierlijk model van AHF door farmacologische reagentia, vele hepatotoxine zoals d-galactosamine8paracetamol9tetrachloorkoolstof10, thioacetamide11, Concanavalin A12, lipopolysaccharide13 , enz., zijn gebruikt. In deze lijst elk reagens genereert een unieke reeks van functies voor AHF, maar helaas geen enkele reagens bootst de menselijke AFH. Bovendien, de AFH geïnduceerd door hepatotoxine lang duurt, waardoor dieren onder chronische stress, en reproduceerbare resultaten zijn moeilijk te verkrijgen.
Aan de andere kant, de chirurgische ingreep van gedeeltelijke hepatectomy (PHx) is vaardigheid afhankelijk, en reproduceerbare resultaten zijn eenvoudig te verkrijgen na het ontwikkelen van de vereiste vaardigheden. Om te induceren AHF door chirurgische ingreep alleen, is resectie van meer dan 70% van de lever vereist; echter getransplanteerde minder dan een 70% hepatectomy kan nog steeds worden gebruikt om de studie van engraftment en verspreiding van cellen in de lever voor het analyseren van hun therapeutische capaciteit tijdens leverschade14. De transplantatie van hepatocyten geweest uitgevoerd post hepatectomy via het buikvlies15, staart ader16, hepatische ader17of de milt18. Op dit moment, zijn hepatische ader infusie en intrasplenic transplantatie van hepatocyten de aangewezen procedures, zoals ze gemakkelijker zijn te reproduceren.
In dit document, hebben we een procedure voor een gedeeltelijke hepatectomy van 30% in KNIPOOG beschreven. SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J) muizen waarin de linker kwab van de lever is weggesneden. Het wordt gevolgd door transplantatie van 0,2 miljoen GFP waarin muis (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) hepatocyten evenals menselijke oorsprong NeoHep19 in de milt. Deze procedure leidt tot engraftment van de getransplanteerde cellen in de lever. Deze procedure is de minst invasieve en een minimaal pijnlijke techniek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gedeeltelijke hepatectomy is een gevestigde techniek voor behandelende lever regeneratie en buitensporige hepatectomy is gemeld na te bootsen de AHF model. Dierlijke modellen van AFH behoren knaagdieren, met name muizen, tot de meest onderzochte model. Om op te halen van een model van de lever schade bij muizen, tot een 70% hepatectomy is gemeld met een goede overleving tarief25,26. Echter in naakt en andere immunodeficiëntie muis, een 70% hepatectomy is gemeld …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de core subsidie ontvangen van de afdeling van de biotechnologie, van de Indiase regering aan de nationale Instituut van immunologie, New Delhi. Dr. Bhattacharjee de huidige adres is een divisie van gastro-enterologie, leverziekten en voeding, Children’s Hospital Los Angeles.
Materials
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase’s analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure?. Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients’ Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- . . Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients’ Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
