मंजूरी में आंशिक Hepatectomy के बाद हेपैटोसाइट्स की Intrasplenic ट्रांसप्लांटेशन । SCID चूहों
Summary
हम आंशिक hepatectomy (PHx) और मंजूरी में तिल्ली के माध्यम से सेल प्रत्यारोपण प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है । SCID (मंजूरी. CB17-Prkdcscid/J) चूहों. इस प्रोटोकॉल में, एक चीरा बेनकाब करने के लिए और कोशिकाओं के intrasplenic प्रत्यारोपण के लिए एक और चीरा द्वारा पीछा जिगर की बाईं पालि कीट बना दिया है.
Abstract
आंशिक hepatectomy जिगर पुनर्जनन और विभिन्न रोग की स्थिति में कोशिका आधारित चिकित्सीय उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी और reproducible विधि है । आंशिक hepatectomy भी जिगर की ओर neovascularization और कोशिका प्रवास में तेजी लाकर प्रत्यारोपण कोशिकाओं की वृद्धि हुई engraftment और प्रसार की सुविधा । यहां, हम एक गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह की तिल्ली में 30% hepatectomy और कोशिकाओं के प्रत्यारोपण प्रदर्शन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन/गंभीर संयुक्त immunodeficient मंजूरी । SCID (मंजूरी. CB17-Prkdcscid/J) माउस ।
इस प्रक्रिया में, दो छोटे चीरा बनाया जाता है । पहला चीरा का पर्दाफाश करने के लिए और जिगर की बाईं पालि कीट है, और एक और छोटा सा चीरा कोशिकाओं के intrasplenic प्रत्यारोपण के लिए तिल्ली का पर्दाफाश करने के लिए किया जाता है । इस प्रक्रिया में किसी विशेष शल्य चिकित्सा कौशल की आवश्यकता नहीं है, और यह कम तनाव और दर्द, तेजी से वसूली, और बेहतर अस्तित्व के साथ 5-7 मिनट में पूरा किया जा सकता है । हम एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त माउस (ट्रांसजेनिक C57BL/6-टीजी (UBC-GFP) 30Scha/J), साथ ही hepatocyte मानव मूल की कोशिकाओं की तरह (NeoHep) आंशिक रूप से hepatectomized मंजूरी में से पृथक हेपैटोसाइट्स के प्रत्यारोपण का प्रदर्शन किया है । SCID चूहे ।
Introduction
वर्तमान में, hepatocyte ट्रांसप्लांटेशन गंभीर जिगर विकारों वाले रोगियों के इलाज के लिए पूरे अंग प्रत्यारोपण के लिए एक विकल्प के रूप में प्रस्तावित है । यह माना जाता है कि यह पूरे अंग प्रत्यारोपण के लिए रोगियों1पुल कर सकते हैं । allogenic हेपैटोसाइट्स2के अलावा, xenogenic हेपैटोसाइट्स3 और हेपैटोसाइट्स स्टेम सेल4 से व्युत्पंन पशु मॉडलों में भी जांच की जा रही है । इस संदर्भ में, प्राप्तकर्ता में प्रत्यारोपित कोशिकाओं की होमिंग और engraftment क्षमता तीव्र यकृत विफलता (एएचएफ) में कोशिका आधारित चिकित्सा के लिए एक महत्वपूर्ण कसौटी है.
हेपैटोसाइट्स या hepatocyte की तरह कोशिकाओं के प्रत्यारोपण की जांच के लिए5, एएचएफ एक पशु मॉडल में शल्य6 या औषधीय7 प्रक्रियाओं, कोशिकाओं रोपाई के बाद द्वारा या तो बनाया गया है । औषधीय रिएजेंटों द्वारा एक एएचएफ पशु मॉडल बनाने के लिए, कई hepatotoxins जैसे डी-galactosamine8, एसिटामिनोफेन9, कार्बन टेट्राक्लोराइड10, thioacetamide11, Concanavalin ए12, lipopolysaccharide13 , आदिका प्रयोग किया गया है । इस सूची से, हर एजेंट एएचएफ के लिए सुविधाओं का एक अनूठा सेट उत्पंन करता है, लेकिन दुर्भाग्य से कोई एकल एजेंट मानव एएचएफ नकल । इसके अलावा, hepatotoxins द्वारा प्रेरित एएचएफ एक लंबा समय लगता है, जो पुराने तनाव के तहत पशुओं डालता है, और reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए मुश्किल हैं ।
दूसरी ओर, आंशिक hepatectomy (PHx) की शल्य प्रक्रिया कौशल निर्भर है, और reproducible परिणाम आवश्यक कौशल विकसित करने के बाद प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं । अकेले शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप द्वारा एएचएफ प्रेरित करने के लिए, जिगर की अधिक से अधिक ७०% की लकीर की आवश्यकता है; हालांकि, एक ७०% hepatectomy से कम अभी भी engraftment और जिगर में प्रत्यारोपण कोशिकाओं के प्रसार का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है यकृत क्षति14के दौरान उनकी चिकित्सीय क्षमता का विश्लेषण । हेपैटोसाइट्स के प्रत्यारोपण के बाद hepatectomy15, पूंछ नस16, यकृत नस17, या तिल्ली18के माध्यम से प्रदर्शन किया गया है । वर्तमान में, यकृत नस अर्क और हेपैटोसाइट्स के intrasplenic ट्रांसप्लांटेशन पसंदीदा प्रक्रिया कर रहे हैं, के रूप में वे पुन: पेश करने के लिए आसान कर रहे हैं ।
इस पत्र में, हमने मंजूरी में 30% आंशिक hepatectomy के लिए एक प्रक्रिया बताई है । SCID (मंजूरी. CB17-Prkdcscid/जम्मू) चूहों जिसमें जिगर की बाईं पालि में उत्पाद है । यह २००,००० GFP एक्सप्रेस माउस के प्रत्यारोपण के बाद है (C57BL/6-टीजी (UBC-GFP) 30Scha/जे) हेपैटोसाइट्स साथ ही मानव मूल NeoHep तिल्ली में19 . यह प्रक्रिया जिगर में प्रत्यारोपित कोशिकाओं के engraftment की ओर जाता है । इस प्रक्रिया को कम इनवेसिव और एक ंयूनतम दर्दनाक तकनीक है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
आंशिक hepatectomy जिगर पुनर्जनन की जांच के लिए एक स्थापित तकनीक है, और अत्यधिक hepatectomy एएचएफ मॉडल की नकल करने के लिए सूचित किया है । एएचएफ, कुतर, विशेष रूप से चूहों के पशु मॉडलों के बीच, सबसे शोध मॉडल हैं । चूहों में ए…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह कार्य जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत सरकार के राष्ट्रीय संस्थान इम्यूनोलॉजी, नई दिल्ली से प्राप्त कोर अनुदान द्वारा समर्थित था. डॉ भट्टाचार्य वर्तमान पता गैस्ट्रोएंटरोलॉजी, हीपैटोलॉजी और पोषण, बच्चों के अस्पताल लॉस एंजिल्स के प्रभाग है ।
Materials
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
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