Intrasplenic transplantasjon av hepatocytter etter delvis Hepatectomy i NIKK. SCID mus
Summary
Vi har beskrevet en protokoll for å utføre delvis hepatectomy (PHx) og cellen transplantasjon via milt i NIKK. SCID (NIKKER. CB17-Prkdcscid/j) mus. Denne protokollen, er et snitt gjort å avdekke og resect den venstre flik av leveren etterfulgt av en annen snitt for intrasplenic transplantasjon av celler.
Abstract
Delvis hepatectomy er en allsidig og reproduserbar metode lever foryngelse og effekten av cellen basert legemiddelselskap i ulike patologiske forhold. Delvis hepatectomy forenkler også økt engraftment og spredning av transplantert celler ved akselererende neovascularization og celle migrasjon mot leveren. Her beskriver vi en enkel protokoll for utføre 30% hepatectomy og transplantasjon av celler i milten av en ikke-obese diabetiker/alvorlig kombinert immunodeficient hilsen. SCID (NIKKER. CB17-Prkdcscid/j) musen.
I denne prosedyren er to små snitt gjort. Den første snittet er å avsløre og resect den venstre flik av leveren, og en annen liten snitt lages for å avsløre milten for intrasplenic transplantasjon av celler. Denne prosedyren krever ikke noen spesialisert kirurgiske ferdigheter, og det kan være ferdig i 5-7 minutter med mindre stress og smerte, raskere restitusjon og bedre overlevelse. Vi har vist transplantasjon av hepatocytter isolert fra en grønn fluorescerende protein (GFP) uttrykker mus (transgene C57BL/6-vs (UBC-GFP) 30Scha/J), samt hepatocyte som celler av menneskets opprinnelse (NeoHep) i delvis hepatectomized hilsen. SCID mus.
Introduction
Foreløpig er hepatocyte transplantasjon foreslått som et alternativ til hele organtransplantasjon for behandling av pasienter med alvorlig lever lidelser. Det antas at det kan bygge bro pasienter til hele organ transplantasjon1. I tillegg til allogenic hepatocytter2, blir xenogenic hepatocytter3 og hepatocytter avledet fra stamceller4 også undersøkt i dyremodeller. I denne sammenheng, homing og engraftment er potensialet transplantert cellene i mottakeren et viktig kriterium for cellen basert terapi i akutt hepatic fiasko (AHF).
For å undersøke transplantasjon av hepatocytter eller hepatocyte-lignende celler5, opprettes AHF i en dyremodell kirurgisk6 eller farmakologiske7 prosedyrer, etterfulgt av transplanting celler. Å lage en AHF dyr modell av farmakologiske reagenser, mange hepatotoxins som d-galactosamine8, Paracetamol9, carbon tetrachloride10, thioacetamide11, Concanavalin A12, lipopolysakkarid13 , osv., har blitt brukt. Hver reagens genererer et unikt sett med funksjoner for AHF fra denne listen, men dessverre ikke enkelt reagens etterligner den menneskelige AHF. Videre AHF indusert av hepatotoxins tar lang tid, som setter dyr kronisk stress, og reproduserbar resultatene er vanskelig å få.
På den annen side, kirurgiske prosedyren for delvis hepatectomy (PHx) er ferdighet avhengige, og reproduserbar resultatene er lett å få etter å utvikle nødvendige ferdigheter. For å indusere AHF av kirurgiske inngrep alene, er fjerning av mer enn 70% av leveren påkrevd. men transplantert mindre enn en 70% hepatectomy kan fortsatt brukes til å studere engraftment og spredning av celler i leveren for å analysere deres terapeutiske kapasitet under leverskader14. Transplantasjon av hepatocytter har vært utført innlegg hepatectomy gjennom peritoneum15, hale blodåre16, hepatic blodåre17eller milt18. Foreløpig er hepatic blodåre-infusjon og intrasplenic transplantasjon av hepatocytter den foretrukne prosedyrer, fordi de er lettere å reprodusere.
I dette papiret, har vi beskrevet en prosedyre for en 30% delvis hepatectomy i NIKK. SCID (NIKKER. CB17-Prkdcscid/J) mus som den venstre flik av leveren er forbrukeravgift. Det er etterfulgt av transplantasjon 0,2 millioner GFP uttrykke mus (C57BL/6-vs (UBC-GFP) 30Scha/J) hepatocytter samt menneskelige opprinnelse NeoHep19 i milten. Denne fremgangsmåten fører til engraftment av transplantert cellene i leveren. Denne fremgangsmåten er de minst invasive og en minimal smertefulle teknikk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Delvis hepatectomy er en etablert teknikk for undersøke leveren gjenfødelse, og overdreven hepatectomy rapporteres å etterligne AHF modellen. Blant dyr modeller av AHF er gnagere, spesielt mus, mest undersøkte modellen. For å få en leverskade modell i mus, til en 70% hepatectomy har blitt rapportert med en god survival rate25,26. Men i naken og andre immunodeficient mus, en 70% hepatectomy ble rapportert som fatale og dyr døde innen 24 timer<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av kjernen bevilgning mottatt fra Department of bioteknologi, Indias regjering til de nasjonale Institutt for immunologi, New Delhi. Dr. Bhattacharjees nåværende adresse er delingen av gastroenterologi, Hepatology og ernæring, Children’s Hospital i Los Angeles.
Materials
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase’s analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure?. Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients’ Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- . . Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients’ Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
