Intrasplenic trasplante de hepatocitos después de Hepatectomy parcial en cabeceo. Ratones de SCID
Summary
Hemos descrito un protocolo para la realización de hepatectomía parcial (PHx) y trasplante de la célula vía bazo en cabeceo. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/j) ratones. En este protocolo, se realiza una incisión para exponer y resecar el lóbulo izquierdo del hígado, seguido por otra incisión para el intrasplenic trasplante de células.
Abstract
Hepatectomía parcial es un método versátil y reproducible para el estudio de la regeneración hepática y el efecto de la terapéutica celular basado en diversas condiciones patológicas. Hepatectomía parcial también facilita el engraftment aumento y proliferación de las células trasplantadas por neovascularización aceleración y migración de células hacia el hígado. Aquí, describimos un protocolo simple para realizar 30% hepatectomía y trasplante de células en el bazo de un no obeso diabético grave había combinado NOD inmunodeficiente. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/j) ratón.
En este procedimiento, se realizan dos pequeñas incisiones. La primera incisión es para exponer y resecar el lóbulo izquierdo del hígado, y otra pequeña incisión para exponer el bazo para el intrasplenic trasplante de células. Este procedimiento no requiere ninguna habilidad quirúrgica especializada y puede realizarse en 5-7 minutos con menos estrés y dolor, una recuperación más rápida y mejor supervivencia. Hemos demostrado el trasplante de hepatocitos aislados de una proteína fluorescente verde (GFP) expresando su ratón (transgénicos C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), así como los hepatocitos como células de origen humano (NeoHep) en hepatectomized parcialmente NOD. Ratones de SCID.
Introduction
Actualmente, trasplante de hepatocitos es propuesto como una alternativa al trasplante de órgano entero para tratar a los pacientes tener severos trastornos hepáticos. Se cree que puede superar a los pacientes de trasplante de órgano entero1. Además de los hepatocitos alogénicos2, hepatocitos xenogénica3 y hepatocitos derivados de las células4 también están siendo investigados en modelos animales. En este contexto, el engraftment y autoguiado hacia el blanco potencial de las células trasplantadas en el receptor es un criterio importante para la terapia celular basada en la insuficiencia hepática aguda (AHF).
Para investigando el trasplante de hepatocitos o de hepatocitos como las células5, AHF se crea en un modelo animal por quirúrgico6 o procedimientos farmacológicos7 , seguidos de transplante de células. Para hacer un modelo animal de la AHF por reactivos farmacológicos, muchas hepatotoxins como la d-galactosamina8, acetaminofén9, tetracloruro de carbono10, tioacetamida11, concanavalina A12, lipopolysaccharide13 , etcetera., se han utilizado. De esta lista, cada reactivo genera un conjunto de características únicas para AHF, pero lamentablemente no solo reactivo imita el humano AHF. Por otra parte, el AHF inducido por hepatotoxins lleva mucho tiempo, que pone a los animales bajo estrés crónico, y son difíciles de obtener resultados reproducibles.
Por otra parte, la intervención quirúrgica de hepatectomía parcial (PHx) es dependiente de la habilidad y la reproducibilidad es fácil de obtener después de desarrollar las habilidades necesarias. Para inducir AHF por solo la intervención quirúrgica, la resección de más del 70% del hígado se requiere; sin embargo, menos de una hepatectomía del 70% todavía puede ser utilizada para estudiar el engraftment y proliferación de trasplantar las células en el hígado para analizar su capacidad terapéutica en daño hepático14. El trasplante de hepatocitos han sido realizadas post hepatectomía por el peritoneo15, cola vena16, vena hepática17o el18del bazo. Actualmente, la infusión de la vena hepática y intrasplenic trasplante de hepatocitos son los procedimientos preferidos, ya que son fáciles de reproducir.
En este trabajo hemos descrito un procedimiento de una hepatectomía parcial del 30% en cabeceo. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/J) ratones en el que el lóbulo izquierdo del hígado es suprimido. Es seguida por el trasplante de hepatocitos de ratón (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) expresando GFP 0,2 millones así como origen humano NeoHep19 en el bazo. Este procedimiento conduce al engraftment de células trasplantadas en el hígado. Este procedimiento es menos invasivo y una técnica mínimamente dolorosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hepatectomía parcial es una técnica establecida para investigar la regeneración hepática y hepatectomía excesiva se divulga para imitar el modelo de AHF. Entre los modelos animales de AHF, roedores, especialmente ratones, son el modelo más investigado. Para obtener un modelo de daño hepático en ratones, hasta una hepatectomía del 70% se ha divulgado con una buena supervivencia tasa25,26. Sin embargo en nude y otro ratón inmunodeficiente, una hepatectom?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la concesión de la base recibida del Departamento de biotecnología, gobierno de la India en el Instituto Nacional de Inmunología, en Nueva Delhi. Dirección actual del Dr. Bhattacharjee es la división de Gastroenterología, Hepatología y nutrición, Hospital Los Ángeles de los niños.
Materials
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
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