Isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain

Summary

Ce protocole vise à isoler les cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical. Parmi les applications incluent l’utilisation de ces cellules comme biomarqueur pour identifier les patients à risque cardiovasculaire, traitement des maladies ischémiques, et constructions de création valve tissulaire cardiaque et vasculaire.

Abstract

L’existence de cellules endothéliales progénitrices (EPCs) dans le sang périphérique et son implication dans la vasculogénèse a été signalée par Ashara et ses collègues¹. Plus tard, d’autres documenté l’existence de types similaires de EPCs provenant de la moelle osseuse^2,3. Plus récemment, Yoder et Ingram a révélé que EPCs provenant du sang de cordon ombilical avaient un potentiel prolifératif plus élevé par rapport à ceux isolés d’adulte périphérique de sang^4,5,6. En dehors de n’être impliqué en postnatal vasculogénèse, EPCs ont également montré des promesse comme une source de cellules pour créer tissulaire cardiaque et vasculaire vanne constructions^7,8. Il existe différents protocoles d’isolement, dont certaines impliquent le tri cellulaire des cellules mononucléaires (PTM) dérivés les sources mentionnées plus tôt avec l’aide de marqueurs endothéliales et hématopoïétiques, ou cultivant ces multinationales avec la croissance endothéliale spécialisée moyenne, ou une combinaison de ces techniques⁹. Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement et culture des CPE à l’aide spécialisée endothélial additionné de facteurs de croissance, sans utiliser d’immunosorting, suivie de la caractérisation des cellules isolées à l’aide de Western Blot et immunomarquage.

Introduction

Plusieurs chercheurs ont étudié les caractéristiques et le potentiel humain EPCs^{5,10,11,12,13}. CPE peut être qualifiée de circuler les cellules qui ont la capacité d’adhérer aux tissus endothéliales dans les sites d’hypoxie, ischémie, des blessures ou la formation de tumeurs et contribuent à la formation de nouvelles structures vasculaires^4,14. Leur implication observée dans la néovascularisation, sous forme de vasculogénèse postnatal, a conduit à la compréhension de la physiopathologie de ces cellules et leur utilisation dans des applications thérapeutiques^{4,15, 16}. le nombre de CPE chez un individu s’est avéré être en corrélation avec la pathologie cardiovasculaire^{9,15,16,17,18,19 ,},²⁰. D’autres études ont également différenciées EPCs dans un phénotype de fibroblastes-comme soupape et proposé que ces cellules pourraient être utilisées pour l’ingénierie tissulaire cardiaque vannes^7,21.

Les molécules de surface de cellule particulière nécessaires pour isoler les EPCs n’ont pas été clairement identifiés en raison de divergences entre les enquêtes⁴. L’adhérence des multinationales à une certaine matrice, avec une exposition à une variété de conditions de culture, a été interprétée par plusieurs groupes^1,17,22,23, suggérant que putatifs EPCs peuvent afficher les différentes propriétés phénotypiques. Ces propriétés incluent un manque de capacité de phagocytose, la formation du tube en Matrigel et la captation des lipoprotéines de basse densité Dil-acétylé. La haute clonogéniques et potentiel prolifératif sont deux propriétés avec laquelle EPCs peuvent être hiérarchisés⁵. CPE peut également former des tubules in vitro lorsque co-cultivées avec des poumons foetaux humains fibroblastes⁴. Ces cellules sont connues pour exprimer des marqueurs de surface des cellules endothéliales et de partager certaines des marqueurs hématopoïétiques^13,24,25. Les marqueurs positivement exprimées largement acceptées pour le phénotypage EPCs sont CD31, CD34, récepteur de facteur de croissance endothélial vasculaire 2 (VEGFR2), von Willebrand (vWF) de facteur, CD133, c-Kit et vasculaires endothéliales cadhérine (VE-cadhérine)^{4 , 18}. cellules qui expriment conjointement CD90, CD45, CD14, CD115 ou actine muscle lisse-alpha (α-SMA) ne sont pas considérés comme être EPCs en raison de leur capacité potentielle, proliférative limitée à phagocyter les bactéries et incapacité de former de novo humaine navires en vivo^4,7. Cet article décrit un protocole modifié pour l’isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain sans besoin de n’importe quelle cellule protocoles de tri. Pour cet article, nous avons utilisé le CD31, CD34 et VEGFR2 comme les marqueurs positifs, avec α-SMA comme indicateur négatif.

Dans cet article, nous proposons une méthode d’isoler et de cultiver des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical sans cellule tri à l’aide spécialisée de milieu de croissance endothéliale additionné de facteurs de croissance (EGM). Cette EGM contient le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance fibroblastique (FGF), qui améliorent la survie, la prolifération et la migration des cellules endothéliales²⁶. Il comprend également l’acide ascorbique, qui est responsable du maintien de la morphologie de pavées des cellules ; insuline-comme le facteur de croissance-1 (IGF-1), qui fournit angiogénique et fonction migrateur ; et l’héparine, ce qui provoque la meilleure stabilité à long terme des facteurs de croissance en moyenne²⁶. Autres facteurs de croissance, ajoutés le milieu de culture de cellules endothéliales comprend une supplémentation en facteur de croissance épidermique (EGF), qui aide à stimuler la prolifération cellulaire et la différenciation et hydrocortisone, qui sensibilise les cellules à EGF²⁶ . Nous montrons que l’utilisation de ce support de croissance spécifique conduit à un nombre plus élevé de l’EPCs par rapport à la moyenne basale endothéliale (EBM) ou moyen d’Eagle modifié (DMEM de Dulbecco).

Protocol

cette recherche a été menée avec l’approbation de l’Université de l’Arkansas, Institutional Review Board (numéro d’agrément 16-04-722). Unités de sang de cordon ombilical ont recueilli dans une solution de dextrose (CPD) citrate phosphate à l’Arkansas Cord Blood Bank, et les unités qui ne respectent pas l’obligation de stockage ont été données pour la recherche. Unités de sang de cordon ont été envoyées au laboratoire au sein de la collection à une température ambiante de 24 h. <p class…

Representative Results

Isolement et l’Expansion des cellules progénitrices endothéliales :Un schéma (Figure 1) est fourni en décrivant le protocole global. Les couches de composants sanguins différents ont été observés après centrifugation en gradient de densité du sang de cordon ombilical humain avec milieu de gradient de densité. Après ensemencement MNCs sur les plaques imprégnées sur le collagène, l’excroissance des colonies fut observée…

Discussion

Comme mentionné précédemment, adhérent EPCs possèdent une morphologie pavées. Nos multinationales isolés a progressé d’une colonie de cellules fusiformes (Figure 2A-2D) dans les premiers stades à une colonie de pavées (Figure 2E-2F) sur une période de dix jours de culture. CPE ont été étiquetés différemment par les différents groupes de recherche, à savoir comme fin de cellules progénitrices endothéliales<s…

Materials

A) For isolation and culturing
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium
Fetal Bovine Serum	Thermofisher Scientific	26140079
Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X)	Thermofisher Scientific	10378016
Ficoll-Paque	GE Heatlhcare	17-1440-02
Hank's Balanced Salt Solution	Thermofisher Scientific	14170-112
Ammonium Chloride	Stem Cell Technologies	7850
1X Phosphate Buffer Saline	Thermofisher Scientific	14190250
Rat Tail I Collagen	Corning	354236
Glacial Acetic Acid	Amresco	0714-500ML
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300054
HEPES buffer	Thermofisher Scientific	15630080
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Thermofisher Scientific	10566-016
B) Antibodies and cell lysates
CD31	Abcam	ab28364	1:250 dilution  for Western blotting
CD34	Santa Cruz Biotechnology	sc-7045	1:100 dilution for Western blotting
α-SMA	abcam	ab5694	1:100 dilution for Western blotting
α-tubulin	abcam	ab7291	1:2500 dilution for Western blotting
VEGFR2	abcam	sc504	1:100 dilution for Western blotting
Human umbilical vein endothelial cell lysate	Santa Cruz Biotechnology	sc24709
Valve interstitial cell lysate			Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer
C) Western blotting and immunostaining
10X Tris/Glycine/SDS buffer	Biorad	161-0772	Used as running buffer
10X Tris/Glycine buffer	Biorad	161-0771	Used as transfer buffer
Immobilon-FL transfer membrane	Merck Millipore	IPFL0010	This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane
4X Laemmli sample buffer	Biorad	161-0747
2-mercaptoethanol	Biorad	161-0710
10% Criterion TGX precast gel	Biorad	5671033
Prolong Gold antifade	Thermofisher Scientific	P36930	Used for mounting immunostained coverslips for long term storage
Methanol	VWR Analytical	BDH1135-4LP