Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist, endotheliale Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut zu isolieren. Einige der Anwendungen sind mit diesen Zellen als Biomarker für die Identifizierung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Risiko, Behandlung von ischämischen Erkrankungen und Erstellen von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil konstruiert.
Abstract
Die Existenz von endothelialen Progenitorzellen (EPC) im peripheren Blut und seine Einbindung in Vaskulogenese wurde zuerst von Ashara und Kollegen1berichtet. Später, dokumentiert andere die Existenz von ähnlichen Arten von EPC aus dem Knochenmark2,3. Vor kurzem hatte Yoder und Ingram zeigte, dass Nabelschnurblut EPCs abgeleitet ein höheres proliferative Potential im Vergleich zu denen von Erwachsenen peripheren isoliert Blut-4,5,6. Neben der postnatalen Vaskulogenese beteiligt zu sein, haben EPC auch Versprechen als eine Zelle Quelle für die Erstellung von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil Konstrukte7,8gezeigt. Verschiedenen Isolierung Protokolle sind vorhanden, von denen einige beinhalten Zellsortierung mononukleären Zellen (MNU) abgeleitet aus den Quellen erwähnt mit Hilfe von Endothelzellen und hämatopoetischen Marker oder Kultivierung dieser multinationalen Unternehmen mit spezialisierten endothelial Wachstum Medium, oder eine Kombination dieser Techniken-9. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung und Kultur des EPC mit spezialisierten Endothelzellen Medium ergänzt mit Wachstumsfaktoren, ohne den Einsatz von Immunosorting, gefolgt von der Charakterisierung von der isolierten Zellen mittels Western blotting und Immunostaining.
Introduction
Mehrere Forscher untersuchten die Eigenschaften und das Potential der menschlichen EPCs5,10,11,12,13. EPC können beschrieben werden als Zellen, die Fähigkeit zur Einhaltung endothelial Gewebe an Standorten von Hypoxie, Ischämie, Verletzungen oder Tumorbildung und tragen zur Bildung von neuen vaskulären Strukturen4,14in Umlauf. Ihre beobachteten Beteiligung an Neovaskularisation, in Form von postnatale Vaskulogenese, führte zu einem Verständnis der Pathophysiologie der diese Zellen und deren Anwendung in therapeutischen Anwendungen4,15, 16. die Anzahl der EPC im Einzelfall nachweislich korreliert mit Herz-Kreislauf-Pathologie9,15,16,17,18,19 ,20. Andere Studien haben auch differenzierte EPC in einem Ventil Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp und schlug vor, dass diese Zellen für Gewebe-Engineering Herz Ventile7,21verwendet werden könnten.
Bestimmte Zelle Oberfläche Moleküle EPCs isolieren musste wurden aufgrund von Unstimmigkeiten zwischen den Untersuchungen4nicht eindeutig identifiziert. Die Haftung der multinationalen Konzerne zu einer bestimmten Matrix, mit der Exposition gegenüber einer Vielzahl von Kulturbedingungen durchgeführt worden durch mehrere Gruppen1,17,22,23, was darauf hindeutet, dass vermeintliche EPCs kann unterschiedlichen phänotypische Eigenschaften anzeigen. Zu diesen Eigenschaften gehören einen Mangel an phagocytotic Fähigkeit, Rohr-Bildung in Matrigel und die Aufnahme von Low-Density-Lipoproteine Dil acetyliert. Die hohe klonogenen und proliferative Potential sind zwei Eigenschaften, die mit dem EPC hierarchisierte5werden können. EPC können auch in-vitro- Tubuli wenn mit menschlichen fetalen Lunge Fibroblasten4cocultured bilden. Diese Zellen sind Endothelzellen Oberflächenmarker zum Ausdruck zu bringen und einige der hämatopoetischen Marker13,24,25Teilen bekannt. Die positiv ausgedrückt Marker, die weithin für Phänotypisierung EPCs akzeptiert werden sind CD31, CD34, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (VEGFR2), von-Willebrand-Faktor (vWF), CD133, c-Kit und vaskulären endothelialen Cadherin (VE-Cadherin)4 , 18. Zellen, die CD90, CD45, CD14, CD115 oder Alpha-Glattmuskel Aktin (α-SMA) Co ausdrücken gelten nicht als EPC wegen ihrer begrenzten proliferative potenzielle, Fähigkeit, Phagozytose von Bakterien und die Unfähigkeit, de Novo menschlichen bilden Schiffe in Vivo4,7. Dieser Artikel beschreibt ein modifiziertes Protokoll für die Isolierung von endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut ohne die Notwendigkeit für jede Zelle sortieren Protokolle. In diesem Artikel verwendet CD31, CD34 und VEGFR2 als die positive Markierungen mit α-SMA als negativer Indikator.
In diesem Artikel schlagen wir vor, dass eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von endothelialen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut ohne Zelle sortieren mit endothelialen Wachstumsmedium ergänzt mit Wachstumsfaktoren (EGM) spezialisiert. Diese EGM vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und enthält Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), die das Überleben, Proliferation und Migration von Endothelzellen26zu verbessern. Es enthält auch Ascorbinsäure, die für die Aufrechterhaltung der Kopfsteinpflaster-Morphologie der Zellen verantwortlich ist; Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-1 (IGF-1), die Angiogenese und wandernden Funktion bietet; und Heparin, wodurch verbesserte Langzeitstabilität von Wachstumsfaktoren in der mittleren26. Andere Wachstumsfaktoren hinzugefügt, um die endotheliale Zellkulturmedium umfasst die Supplementation mit epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), die hilft, anregende Zell-Proliferation und Differenzierung und Hydrocortison, die die Zellen EGF26 sensibilisiert . Wir zeigen, dass die Nutzung dieses Mediums spezifischen Wachstumsraten höhere Anzahl von EPC im Vergleich zu Endothelzellen basal Medium (EBM) oder Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM ergibt).
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie bereits erwähnt, anhaftende EPCs besitzen eine Kopfsteinpflaster-Morphologie. Unsere isolierten MNCs entwickelte sich von einer spindelförmigen Zelle Kolonie (Abbildung 2A-2D) in den frühen Stadien zu einer gepflasterten Kolonie (Abbildung 2E-2F) über einen Zeitraum von zehn Tagen in Kultur. EPC haben unterschiedlich von verschiedenen Forschungsgruppen, nämlich als späten endothelial Progenitor Zellen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Material basiert auf Arbeit, unterstützt von der National Science Foundation Grant No. CMMI-1452943 und von der University of Arkansas Ehrenhochschule. Wir möchten auch die Arkansas Nabelschnurblutbank für die uns mit Schnur Blut Einheiten zu erkennen.
Materials
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1X Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10X Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10X Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4X Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
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