Isolering av endoteliale Progenitor celler fra menneskelige navlestrengsblod
Summary
Målet med denne protokollen er å isolere endoteliale progenitor celler fra navlestrengsblod. Noen av programmene inkluderer bruk av disse cellene som en biomarkør for å identifisere pasienter med kardiovaskulær risiko, behandle iskemiske sykdommer, og skape vev-konstruert vaskulær og hjerte ventil konstruksjoner.
Abstract
Eksistensen av endoteliale progenitor celler (EPCs) i perifert blod og dens engasjement i vasculogenesis ble først rapportert av Ashara og kolleger1. Senere dokumentert andre eksistensen av lignende typer EPCs fra benmargen2,3. Flere nylig, Yoder og Ingram viste at EPCs avledet fra navlestrengsblod hadde et høyere proliferativ potensial sammenlignet med de isolert fra voksen perifert blod4,5,6. Bortsett fra å være involvert i postnatal vasculogenesis, har EPCs også vist lovende som en celle for å lage vev-konstruert vaskulær og hjerte ventil konstruksjoner7,8. Ulike isolasjon protokoller finnes, innebære noen som cellen sorteringen av mononukleære celler (MNCs) fra kilder som er nevnt tidligere ved hjelp av endothelial og blodkreft markører eller dyrking disse MNCs med spesialiserte endothelial vekst medium, eller en kombinasjon av disse teknikker9. Her presenterer vi en protokoll for isolasjon og kultur EPCs bruker spesialiserte endothelial medium med vekstfaktorer, uten bruk av immunosorting, etterfulgt av karakterisering av isolerte cellene med vestlige blotting og immunostaining.
Introduction
Flere etterforskere har studert egenskaper og potensialet i menneskelig EPCs5,10,11,12,13. EPCs kan beskrives som sirkulerende celler som har evnen til å overholde endothelial vev i områder av hypoksi, iskemi, skade eller tumor formasjon og bidra til dannelse av nye vaskulære strukturer4,14. De observerte er involvert i neovascularization, i form av postnatal vasculogenesis, har ført til en forståelse av i Patofysiologien ved disse cellene og deres bruk i terapeutiske programmer4,15, 16. antall EPCs i et individ har vist seg å være korrelert med hjerte patologi9,15,16,17,18,19 ,20. Andre studier har også differensiert EPCs i en ventil fibroblast-lignende fenotypen og foreslått at disse cellene kan brukes for tissue engineering hjertet ventiler7,21.
Bestemt celle overflaten molekyler for å isolere EPCs har ikke blitt klart identifisert på grunn av avvik mellom undersøkelser4. Vedheft av MNCs til en bestemt matrise, med eksponering til en rekke kultur forhold, er utført av flere grupper1,17,22,23, antyder at antatte EPCs kan vise ulike fenotypiske egenskaper. Disse egenskapene inkluderer manglende phagocytotic evne, rør formasjon i Matrigel og opptaket av Dil-acetylated low-density lipoproteiner. Den høye clonogenic og proliferativ potensialet er to egenskaper som EPCs kan være hierarchized5. EPCs kan også danne i vitro tubuli når cocultured med menneskelige fosterets lunge fibroblaster4. Disse cellene kalles å uttrykke endothelial celle overflate markører og å dele noen av blodkreft markører13,24,25. Positivt uttrykt markører som er allment akseptert for phenotyping EPCs er CD31, CD34, vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor 2 (VEGFR2), von Willebrand faktor (vWF), CD133, c-Kit og vaskulær endotelial cadherin (VE-cadherin)4 , 18. celler som uttrykker co CD90, CD45, CD14, CD115 eller alpha-glatt muskel utgangen (α-SMA) anses ikke å være EPCs på grunn av deres begrensede proliferativ potensial, evne å phagocytose bakterier og manglende evne til å danne de novo menneskelige fartøy i vivo4,7. Denne artikkelen beskriver en endret protokoll for isolering av endoteliale progenitor celler fra menneskelige navlestrengsblod uten behov for en celle sortering protokoller. For denne artikkelen har brukte vi CD31, CD34 og VEGFR2 som positive markører, med α-SMA som negative indikator.
I denne artikkelen foreslår vi en metode for å isolere og dyrking endoteliale progenitor celler fra navlestrengsblod uten celle sortere ved hjelp av spesialiserte endothelial oppblomstringen medium med vekst faktorer (EGF). Denne EGM inneholder vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og fibroblast vekstfaktor (FGF), som forbedrer den overlevelse, spredning og migrering av endotelceller26. Det inkluderer også askorbinsyre, som er ansvarlig for å opprettholde brosteinsbelagte morfologi av celler. insulin-lignende vekstfaktor-1 (IGF-1), som gir angiogenic og vandrende funksjon; og heparin, som fører til bedre langsiktig stabilitet av vekstfaktorer i middels26. Andre vekstfaktorer lagt til endothelial celle kultur medium inkluderer tilskudd med epidermal vekstfaktor (EGF), som hjelper i stimulere celle spredning og differensiering hydrocortisone, som sensitizes cellene til EGF26 . Vi viser at bruk av denne bestemte vekstmediet gir høyere antall EPCs sammenlignet endothelial basale medium (EBM) eller Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM).
Protocol
Representative Results
Discussion
Som nevnt tidligere, tilhenger EPCs har en brosteinsbelagt morfologi. Vår isolerte MNCs kommet fra en spindel-formet celle koloni (figur 2A-2D) i de tidlige stadiene til en brosteinsbelagt koloni (figur 2E-2F) over en periode på ti dager i kultur. EPCs har blitt merket annerledes av forskjellige forskningsgrupper, nemlig som sent endoteliale progenitor celler10, endothelial kolonien danner celler<sup cl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette materialet er basert på arbeid støttes av National Science Foundation under Grant nr. CMMI-1452943 og ved University of Arkansas utmerkelser College. Vi ønsker også å erkjenne Arkansas Cord Blood Bank for å gi oss med ledningen blod enheter.
Materials
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1X Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10X Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10X Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4X Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 193-199 (2006).
- Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
- Liew, A., Barry, F., O’Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 006692 (2012).
- Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
- Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
- Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
- Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 132-137 (2006).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
- Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
- Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), 181-189 (2000).
- Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
- Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
- Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
- Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
- Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).
