Isolamento de células progenitoras endoteliais de sangue humano do Cordão Umbilical
Summary
O objetivo do presente protocolo é isolar as células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical. Algumas das aplicações incluem o uso dessas células como um biomarcador para identificar pacientes com risco cardiovascular, tratamento de doenças isquêmicas, e criando engenharia de tecido vascular e coração válvula de construções.
Abstract
A existência de células progenitoras endoteliais (EPCs) no sangue periférico e sua participação na vasculogenesis foi primeiramente relatada por Ashara e colegas1. Mais tarde, outros documentada a existência de tipos similares de EPCs provenientes da medula óssea2,3. Mais recentemente, Yoder e Ingram mostraram que os EPCs derivado de sangue de cordão umbilical tinham um potencial proliferativo mais elevado em comparação com os isolados de adulto periférico de sangue4,5,6. Além de estar envolvido em vasculogenesis pós-natal, EPCs mostraram também promessa como uma fonte de célula para criar engenharia de tecido vascular e coração válvula construções7,8. Existem vários protocolos de isolamento, alguns dos quais envolvem a classificação de células de células mononucleares (MNCs) derivadas das fontes mencionadas anteriormente, com a ajuda de marcadores endoteliais e hematopoiéticos ou cultivo essas multinacionais com crescimento endotelial especializado médio, ou uma combinação destas técnicas9. Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento e cultura de EPCs usando especializada endotelial suplementado com fatores de crescimento, sem o uso de immunosorting, seguido pela caracterização das células isoladas usando mancha ocidental e immunostaining.
Introduction
Diversos investigadores estudaram as características e o potencial humano EPCs5,10,11,12,13. EPCs podem ser descritos como circulantes de células que têm a capacidade de aderir ao tecido endotelial em sites de hipóxia, isquemia, lesão ou formação de tumor e contribuir para a formação de novas estruturas vasculares4,14. Seu envolvimento observado em neovascularização, sob a forma de vasculogenesis pós-natal, conduziu a uma compreensão da fisiopatologia destas células e a sua utilização em aplicações terapêuticas4,15, 16. o número de EPCs em um indivíduo foi mostrado para ser correlacionados com patologia cardiovascular9,15,16,17,18,19 ,20. Outros estudos também diferenciadas EPCs em um fenótipo de fibroblasto tipo de válvula e propôs que estas células poderiam ser utilizadas para a engenharia de tecidos coração válvulas7,21.
As moléculas de superfície celular particular precisava isolar EPCs não foram claramente identificadas devido a discrepâncias entre as investigações4. A adesão das multinacionais para uma certa matriz, com a exposição a uma variedade de condições de cultura, foi realizada por vários grupos1,17,22,23, sugerindo que os EPCs putativos pode Exiba Propriedades fenotípicas diferentes. Essas propriedades incluem a falta de capacidade de phagocytotic, formação do tubo em Matrigel e da captação de lipoproteínas de baixa densidade Dil-acetilado. A alta clonogenic e potencial proliferativa são duas propriedades com quais EPCs pode ser hierarquizada5. EPCs podem também formar em vitro túbulos quando cocultured com pulmão fetal humano de fibroblastos4. Estas células são conhecidas para expressar marcadores de superfície de células endoteliais e compartilhar alguns dos marcadores hematopoiéticas13,24,25. Os marcadores positivamente expressos que são amplamente aceitos para fenotipagem EPCs são CD31, CD34, receptor de fator de crescimento vascular endotelial 2 (VEGFR2), von Willebrand (vWF) de fator, CD133, c-Kit e vascular endotelial caderina (VE-caderina)4 , 18. as células que expressam co CD90, CD45, CD14, CD115 ou actina de músculo liso-alfa (α-SMA) não são consideradas ser EPCs devido à sua limitada capacidade potencial, proliferativa de fagocitam bactérias e incapacidade para formar de novo humano vasos na vivo4,7. Este artigo descreve um protocolo modificado para o isolamento de células progenitoras endoteliais humano sangue do cordão umbilical sem necessidade de qualquer célula protocolos de classificação. Neste artigo, usamos CD31, CD34 e VEGFR2 como os marcadores positivos, com α-SMA como o indicador negativo.
Neste artigo, propomos um método de isolamento e cultivo de células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical sem célula classificação usando especializadas suplementado de crescimento endoteliais com fatores de crescimento (EGM). Este EGM contém fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator de crescimento fibroblástico (FGF), que realçam a sobrevivência, proliferação e migração de células endoteliais26. Ele também inclui o ácido ascórbico, que é responsável por manter a morfologia de paralelepípedos de células; insulin-como fator de crescimento-1 (IGF-1), que fornece angiogênico e função migratória; e heparina, que faz com que a melhor estabilidade a longo prazo dos fatores de crescimento no médio26. Outros fatores de crescimento adicionados ao meio de cultura de células endoteliais inclui suplementação com fator de crescimento epidérmico (EGF), que ajuda na proliferação de célula estimulante e diferenciação e hidrocortisona, que sensibiliza as células para EGF26 . Nós mostramos que o uso deste meio de crescimento específico produz maior número de EPCs comparados ao meio basal endotelial (EBM) ou médio de Eagle modificado (DMEM de Dulbecco).
Protocol
Representative Results
Discussion
Como mencionado anteriormente, o aderente EPCs possuem uma morfologia de paralelepípedos. Nossas MNCs isoladas progrediam de uma colônia de células fusiformes (Figura 2A-2D) nas fases iniciais de uma colônia de paralelepípedos (Figura 2E-2F) durante um período de dez dias em cultura. EPCs foram chamadas diferentemente por grupos de pesquisa diferentes, ou seja, como tarde células progenitoras endoteliais…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este material é baseado em trabalho, apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob Grant no. CMMI-1452943 e pelo Colégio de honras da Universidade de Arkansas. Também gostaríamos de reconhecer o banco de sangue de cordão de Arkansas nos fornecer unidades de sangue de cordão.
Materials
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1X Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10X Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10X Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4X Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
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