रोगी ग्लोबब्लास्टोमा शर्त्तेंशन में सेल्यूलर माइक्रोएनेरनर की मात्रात्मक इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री
Summary
क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इमेजजे का उपयोग करते हुए glioblastoma रोगी शोधन में ट्यूमर माइक्रोएन्निनर घटकों की मात्रात्मक रूप से पहचान करने के लिए यह प्रोटोकॉल विकसित किया गया था।
Abstract
ट्यूमर माइक्रोएनेवायरमेंट में बढ़ती रुचि के साथ, हम ग्लिब्ब्लास्टोमा के सबसे खराब और सबसे आक्रामक मस्तिष्क कैंसर के रोगी के नमूनों के भीतर विशेष रूप से microenvironment घटकों का निर्धारण करने के लिए एक विधि विकसित करने के लिए तैयार हैं। न केवल रोगग्रस्त ऊतकों का सही वर्णन करने के लिए फायदेमंद मात्रात्मक विधियां हैं, वे संभावित सटीक पूर्वानुमान, निदान और ऊतक-इंजीनियर प्रणाली और प्रतिस्थापन के विकास में भी योगदान कर सकते हैं। ग्लियोब्लास्टोमा में, माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स जैसे ग्लिएल कोशिका, रोगविज्ञानी ग्रेडिंग के आधार पर स्वतंत्र रूप से खराब निदान के साथ जुड़े हुए हैं। हालांकि, इन कोशिकाओं और अन्य ग्लियाय सेल घटकों की स्थिति को मात्रात्मक रूप से वर्णित नहीं किया गया है। बड़ी प्रक्रियाओं के कारण यह ग्लियाल कोशिकाओं को चिह्नित करने में मुश्किल हो सकती है। इसके अलावा, सबसे ऊतक विज्ञान समग्र टिशू नमूने पर केंद्रित है या केवल ट्यूमर के थोक के भीतर, जैसा कि क्षेत्रों के आधार पर वर्णित मात्रा के अनुसार विरोधबेहद विषम ऊतक हिन यहां, हम ग्लूब्लास्टोमा के मरीजों से ट्यूमर बल्क और ट्यूमर रिसेशंस के आसन्न क्षेत्रों के भीतर ग्लील कोशिकाओं की आबादी को पहचानने और मात्रात्मक रूप से विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। हम क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री का उपयोग रोगी ट्यूमर रिजक्शन और इमेजजे में ग्लियाल सेल आबादी की पहचान करने के लिए किया था, जो प्रत्येक ग्लैबल आबादी के लिए धुंधला के प्रतिशत कवरेज का विश्लेषण करता है। इन तकनीकों के साथ हम glioma tumor microenvironment के क्षेत्रों में glial cells का बेहतर वर्णन करने में सक्षम हैं।
Introduction
ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम), सबसे आम और घातक मस्तिष्क कैंसर है, जिसे प्राथमिक ट्यूमर बल्क से लेकर अत्यधिक स्वस्थ मस्तिष्क पैरेन्काइमा 1 , 2 में फैलता हुआ आक्रमण होता है। यह फैलाना आक्रमण ट्यूमर को विशेष रूप से resect के लिए मुश्किल बना देता है, और अपरिवर्तनीय पुनरावृत्ति 2 , 3 , 4 का सबसे आम कारण पोस्ट-थेरेपी वाले हमलावर कैंसर कोशिकाएं हैं। इससे पहले, हम बाधा फैलाना तंत्रिकाबंधार्बुद सेल आक्रमण उपचारात्मक लाभकारी 5 हो पाया, हालांकि थोड़ा जीबीएम आक्रमण के लिए योगदान दे जटिल तंत्र के बारे में जाना जाता है। कैंसर के आस-पास ट्यूमर माइक्रोएनेरिवन या ऊतक, कई कैंसर 6 , 7 में ट्यूमर की प्रगति में फंस गया है। ग्लोबोब्लास्टोमा ट्यूमर माइक्रोएनेयरमेंट, पी मेंसांप की तरफ, अपेक्षाकृत कम-विशेषता है और विशिष्ट ग्लोबल कोशिकाओं, जैसे कि एस्ट्रोसाइट्स, माइक्रोग्लिया, और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, साथ ही बाह्य मैट्रिक्स, घुलनशील कारक, और बायोफिजिकल कारकों को बनाते हुए विशिष्ट रूप से जटिल है। प्रयोगात्मक रूप से, एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोलिया को ग्लियोमा प्रगति और आक्रमण 8 , 9 , 10 को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, लेकिन देशी मानव मस्तिष्क सूक्ष्म वातावरण में सभी ग्लिअल कोशिकाओं की संरचना अज्ञात है।
हमने पहले दिखाया है कि माइक्रोएनेनलिअनल घटकों ने ग्लिब्लास्टोमा माइक्रोएनेरमेंट के सेल्यूलर घटकों का मात्रात्मक विश्लेषण करके रोगी के अस्तित्व का अनुमान लगाया है और हमारे विश्लेषण को आनुपातिक खतरे मॉडल 11 में शामिल कर सकते हैं । यहां, हम ग्लोब्लास्टोमा रोगी से ट्यूमर बल्क और ट्यूमर रिजक्शन के आसन्न क्षेत्रों में ग्लील कोशिकाओं की आबादी की पहचान करने के लिए मात्रात्मक विश्लेषण पद्धति का वर्णन करते हैं।रों। हम glial सेल आबादी और ImageJ प्रत्येक glial आबादी के लिए धुंधला के प्रतिशत कवरेज का विश्लेषण करने के लिए पहचान करने के लिए क्रोमोजेनिक immunohistochemistry का इस्तेमाल किया। प्रतिशत कवरेज का आकलन कोशिकाओं के आकार संबंधी मतभेदों को निर्धारित करने के लिए एक साधारण माप बनाता है, खासकर कैंसर कोशिकाओं के साथ बातचीत से प्रभावित। हिस्टोपैथोलॉजिकल स्टेंसिंग का इस्तेमाल करने के लिए पिछला अध्ययन मानक स्टेनाइकिंग जैसे कि हेमटोक्सीलीन और ईोसिन 12 या मैसन ट्राइकोम 13 , जो एंटीबॉडी-आधारित इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्केनिंग की विशिष्टता का लाभ नहीं लेते। ग्लोबोब्लास्टोमा रोगी ट्यूमर रिजक्शन के भीतर सीधे ग्लिबल आबादी को मापने के लिए हमारी पद्धति विकसित की गई थी, जिसका उद्देश्य हम जटिल ग्लोबोब्लास्टोमा माइक्रोएन्नेन्मेंट को स्पष्ट करने के लिए उपयोग करना चाहते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे यहां प्रस्तावित पद्धति पारंपरिक क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमिसरी का उपयोग करते हुए दाँव के ऊतक संबंधी नमूने का विश्लेषण करने के लिए एक मात्रात्मक दृष्टिकोण है। इस प्रकार के विश्लेषण के लिए ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक डीआरएस को धन्यवाद देते हैं फहद बफकिह और जिम मंडेल को रोगी के नमूने के अधिग्रहण और पहचान के लिए, गैरेट एफ बीगली को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ सहायता के लिए, और बायोरपोसिटरी और ऊतक अनुसंधान सुविधा, कार्डियोवस्कुलर रिसर्च सेंटर हिस्टोलोजी कोर और वर्जीनिया विश्वविद्यालय में बायोमोलेकुलर विश्लेषण सुविधा के साथ सहायता के लिए नमूना अधिग्रहण, immunohistochemistry, और इमेजिंग।
Materials
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
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