Inmunohistoquímica Cuantitativa del Microambiente Celular en Resecciones de Glioblastoma Paciente

Summary

Este protocolo fue desarrollado para identificar cuantitativamente los componentes del microambiente tumoral en resecciones de pacientes con glioblastoma usando inmunohistoquímica cromogénica e ImageJ.

Abstract

Con el creciente interés en el microambiente tumoral, nos propusimos desarrollar un método para determinar específicamente los componentes del microambiente dentro de muestras de pacientes de glioblastoma, el cáncer de cerebro más mortífero y más invasivo. No sólo son métodos cuantitativos beneficiosos para describir con precisión los tejidos enfermos, sino que también pueden contribuir a un pronóstico más preciso, el diagnóstico y el desarrollo de sistemas de ingeniería de tejidos y reemplazos. En el glioblastoma, las células gliales, tales como microglia y astrocitos, se han correlacionado independientemente con un mal pronóstico basado en la clasificación de patólogos. Sin embargo, el estado de estas células y otros componentes de las células gliales no ha sido bien descrito cuantitativamente. Esto puede ser difícil debido a los grandes procesos que marcan estas células gliales. Además, la mayoría de los análisis histológicos se centran en la muestra de tejido total o sólo dentro de la mayor parte del tumor, en lugar de delinear cuantificaciones basadas en regiones conHin el tejido altamente heterogéneo. Aquí, describimos un método para identificar y analizar cuantitativamente las poblaciones de células gliales dentro de la masa tumoral y regiones adyacentes de resecciones tumorales de pacientes con glioblastoma. Se utilizó inmunohistoquímica cromogénica para identificar las poblaciones de células gliales en resecciones tumorales de pacientes y ImageJ para analizar el porcentaje de cobertura de tinción para cada población glial. Con estas técnicas podemos describir mejor las células gliales a través de las regiones del microambiente tumoral glioma.

Introduction

El glioblastoma (GBM), el cáncer de cerebro más común y maligno, se caracteriza por una invasión altamente difusa desde el tumor primario al parénquima cerebral sano circundante ^{1 , 2} . Esta invasión difusa hace que el tumor sea particularmente difícil de resecar completamente, y las células cancerosas invasoras que permanecen después de la terapia es la razón más común para la recurrencia inevitable ^{2 , 3 , 4} . Anteriormente, se encontró inhibir la invasión difusa de células de glioma de ser terapéuticamente beneficioso [ ^5] , sin embargo poco se sabe sobre los complejos mecanismos que contribuyen a GBM invasión. El microambiente tumoral, o tejido que rodea el cáncer, ha sido implicado en la progresión de tumores en múltiples cánceres [ ^{6 , 7]} . El microambiente tumoral del glioblastoma, en pArticular, está relativamente sub-caracterizada y es singularmente compleja, compuesta de múltiples células gliales, tales como astrocitos, microglia y oligodendrocitos, así como matriz extracelular, factores solubles y factores biofísicos. Experimentalmente, se ha demostrado que los astrocitos y microglia aumentan la progresión e invasión de glioma ^{8 , 9 , 10} , pero se desconoce la composición de todas las células gliales en el microambiente humano nativo del cerebro.

Anteriormente hemos demostrado que los componentes microambientales pueden predecir la supervivencia de los pacientes mediante el análisis cuantitativo de los componentes celulares del glioblastoma microambiente e incorporar nuestros análisis en un modelo de riesgos proporcionales [ ^11] . En este sentido, describimos el método de análisis cuantitativo para identificar las poblaciones de células gliales dentro de la masa tumoral y regiones adyacentes de resecciones tumorales de pacientes con glioblastomaS Se utilizó inmunohistoquímica cromógena para identificar las poblaciones de células gliales y ImageJ para analizar el porcentaje de cobertura de tinción de cada población glial. La evaluación del porcentaje de cobertura crea una medición simple para determinar las diferencias morfológicas de las células, particularmente las afectadas por las interacciones con las células cancerosas. Los estudios previos para cuantificar la tinción histopatológica usan tinción estándar como la hematoxilina y la eosina ¹² o el tricromo ^{13 de} Masson, que no aprovechan la especificidad de la tinción inmunohistoquímica basada en anticuerpos. Nuestro método fue desarrollado para cuantificar directamente las poblaciones gliales dentro de las resecciones tumorales de pacientes con glioblastoma, que se pretende utilizar para elucidar el complejo microambiente glioblastoma.

Protocol

Este protocolo identifica los componentes celulares en las muestras fijadas con formalina fijadas en parafina (FFPE), como es típico para las muestras clínicas bancadas. La inclusión de parafina permite el mejor mantenimiento de la morfología celular y de los tejidos, así como una mejor longevidad de las secciones. Las muestras utilizadas para este análisis se accedieron a través de la Universidad de Virginia Biorepository y Tissue Research Facility. Las muestras de pacientes fueron seleccionadas por un neuropat?…

Representative Results

Para este análisis, se identificaron dos regiones de intereses dentro de nuestras resecciones tumorales – el tumor primario y las regiones adyacentes, principalmente compuestas de tejido sano con células difusas invasoras de cáncer ( Figura 1A , 1B ) – fueron identificadas por neuropatólogos colaboradores en hematoxilina y eosina Muestras. Dentro de cada muestra de pacientes, se identificó tinción positiva para astrocitos ( <strong cla…

Discussion

Nuestro método propuesto aquí es un enfoque cuantitativo para analizar las muestras histológicas teñidas usando inmunohistoquímica cromogénica tradicional. La metodología actual para este tipo de análisis incluye protocolos de tinción similares seguidos de clasificación por patólogos independientes. Este método ha sido confiable, sin embargo, para una serie de aplicaciones, se requiere una comprensión más precisa del maquillaje celular, tal como una mejor comprensión de la heterogeneidad asociada con tumo…

Materials

Xylene	Fisher Chemical	X3P
Ethanol
High pH antigen unmasking solution	Vector Labs	H-3301
TBS
Triton-X	Amresco	9002-93-1
Horse serum
Anti-ALDH1L1	abcam	ab56777
Anti-Iba1	abcam	ab5076
Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1	abcam	ab53041
ImmPRESS anti-goat	Vector Labs	MP-7405
ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit)	Vector Labs	MP-7500
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	216763
ImmPACT DAB substrate	Vector Labs	SK-4105
Hematoxylin counterstain	ThermoScientific	72404
Histochoice Mounting Media	Amresco	H157-475
Aperio Scanscope	Leica Biosystems
Image Scanscope	Leica Biosystems
Super HT PAP Pen	Research Products International	195506