Aislamiento y cultivo de queratinocitos de ratón primario de piel de ratón neonatal y adulto
Summary
Los queratinocitos epidérmicos forman una barrera cutánea funcional y se sitúan en la línea de frente de la defensa del huésped contra insultos ambientales externos. Aquí se describen métodos de aislamiento y cultivo primario de queratinocitos epidérmicos de piel de ratón neonatal y adulto, e inducción de diferenciación terminal y respuesta inflamatoria desencadenada por UVB a partir de queratinocitos.
Abstract
El queratinocito (KC) es el tipo celular predominante en la epidermis, la capa más externa de la piel. Los KC epidérmicos juegan un papel crítico en la provisión de la defensa de la piel formando una barrera cutánea intacta frente a insultos medioambientales, tales como irradiación con UVB o patógenos, y también iniciando una respuesta inflamatoria sobre dichos insultos. Aquí se describen métodos para aislar KCs de la piel del ratón neonatal y de la piel de la cola de ratón de adultos. También describimos las condiciones de cultivo utilizando suplementos de crecimiento definidos (dGS) en comparación con el suero bovino fetal chelexed (cFBS). Funcionalmente, mostramos que los KC neonatales y adultos son altamente sensibles a la alta diferenciación terminal inducida por calcio, a la formación de juntas estrechas ya la estratificación. Además, los KC adultos cultivados son susceptibles a la muerte celular desencadenada por UVB y pueden liberar grandes cantidades de TNF tras la irradiación con UVB. En conjunto, los métodos descritos aquí serán útiles para los investigadores para la configuración del modelo in vitroS para estudiar la biología epidérmica en el ratón neonatal y / o en el ratón adulto.
Introduction
La piel es el órgano más grande del cuerpo con la epidermis como la capa externa más. La epidermis juega un papel crítico en la formación de una barrera epidérmica intacta para separar el cuerpo del medio ambiente y, por lo tanto, previene la pérdida de agua y protege contra insultos medioambientales, como alergenos, patógenos y exposición a UVB. La epidermis se desarrolla a partir de una sola capa de queratinocitos basales no diferenciados (KCs) en un epitelio estratificado multicapa que consiste en una capa basal, seguida de una capa espinosa, capa granular y estrato córneo. Los KCs basales, que consisten en células madre epidérmicas y células que amplifican el tránsito, son proliferativos e indiferenciados. A medida que los KC basales abandonan el ciclo celular, las células se comprometen con la diferenciación y migran gradualmente hacia la superficie de la epidermis, acompañadas por la maduración de las uniones célula-célula y la formación de una barrera de permeabilidad epidérmica (EPB). Los KCs en la capa espinosa expresan diferenciación tempranaMarcadores de iones tales como queratina 10 (K10); A medida que los KC migran a la capa granular, las células expresan marcadores de diferenciación tardía tales como Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) e Involucrin (INV). En el estrato córneo, los KCs se convierten en corneocitos terminalmente diferenciados, los cuales son finalmente eliminados a través de la descamación a medida que las nuevas células los reemplazan.
El calcio es considerado el agente más fisiológico en la epidermis y desencadena la diferenciación in vitro e in vivo de una manera similar. En la epidermis de piel normal, los iones de calcio forman un "gradiente de concentración" característico, aumentando su concentración hacia la superficie de la piel 1 , 2 , 3 . La concentración de calcio se eleva desde niveles bajos en las subcapas más bajas (capas basales y espinosas) hasta un pico en la capa granular superior y luego cae a niveles insignificantes en la capa más superficial (estrato córneo). El gradiente de calcio también se desarrolla de forma coincidente con la aparición de una barrera de permeabilidad de componentes, lo que apoya que la señalización del calcio juega un papel crítico de la diferenciación de KC. In vitro , el bajo contenido de calcio (0,02-0,1 mM) mantiene la proliferación de KC basales como una monocapa, mientras que el alto contenido de calcio (> 0,1 mM) induce un compromiso rápido e irreversible de las células a la diferenciación terminal como lo demuestra la formación e inducción de juntas estrechas De LOR e INV sobre el tratamiento de alto calcio a los KC basales 4 , 5 .
Además de la formación de barreras, los KC epidérmicos son también un componente importante del sistema inmune innato de la piel. En respuesta a patógenos o patrones moleculares asociados a daños (DAMPs) liberados por irradiación UVB o lesión, los KC pueden producir grandes cantidades de citoquinas inflamatorias, tales como TNFα, IL6 e IFNβ, lo que conduce a la activación del sistema inmune> 6 , 7 , 8 , 9 . Aunque la señalización inflamatoria adecuada de KCs se requiere para el aclaramiento de patógenos, la respuesta inflamatoria no controlada puede desencadenar el desarrollo de enfermedades de la piel auto-inflamatorias, como la psoriasis y la rosácea [ 6 , 8] .
En general, KC juegan un papel vital en el mantenimiento de la barrera de la piel intacta y el inicio de una respuesta inmune en la invasión de patógenos o insultos medioambientales. Por lo tanto, el cultivo primario de KCs epidérmicos es una técnica útil para estudiar la biología epitelial, la diferenciación de KC, así como las respuestas inmunes innatas estimuladas por KC. El aislamiento y cultivo de KCs epidérmicas de ratón primario puede ser un proceso desafiante debido a la susceptibilidad de KC y sensibilidad a diversos estimulantes externos. Aquí describimos un método para aislar y cultivar KC de piel de ratón neonatal oPiel de la cola del ratón adulto. Para el aislamiento adulto de KC, no usamos piel dorsal de ratón porque aislar cantidades suficientes de KC viables de este tejido puede ser difícil por las siguientes razones: Primero, la piel dorsal adulta en la fase de reposo del ciclo del cabello (telógeno) consiste en una Con sólo 1-2 capas de células, lo que conduce a un rendimiento celular bajo y la separación ineficiente de la epidermis de la dermis, que es el paso crítico para el aislamiento de KC con éxito. En segundo lugar, la alta densidad del folículo piloso que está presente en la piel dorsal adulta contribuye a la dificultad de separar la epidermis de la dermis. En cambio, usamos rutinariamente la piel de la cola como la fuente para KCs de ratón adulto ya que este epitelio es más grueso con 3-5 capas de KCs epidérmicos. También tiene una menor densidad de folículos pilosos, que no interfiere con la separación epidérmica, permitiendo así el aislamiento de KC de cualquier cola de cola de ratón adulto independientemente de la edad y la etapa de ciclo del cabello del ratón. El neona aisladoTal KCs se sembraron a las placas de cultivo recubiertas de gelatina, mientras que los platos recubiertos de colágeno se utilizan para sembrar KCs adultos aislados debido a la capacidad disminuida de las células adultas para adherirse en comparación con sus contrapartes neonatales. Para cultivar KCs de ratón, el medio basal de calcio bajo se complementa con dGS, que contiene factor de crecimiento epidérmico (EGF), transferrina bovina, factor de crecimiento insulina-likec1 (IGF1), prostaglandina E2 (PGE2), seroalbúmina bovina (BSA) e hidrocortisona. Entre 2-4 dıas después de la plaqueta inicial, la mayorıa de los KC diferenciados pueden ser lavados durante los cambios diarios de medio, y las restantes células adherentes muestran una morfologıa tıpica de adoquın 4 , proliferan y no expresan el marcador de diferenciación temprana K10.
Protocol
Representative Results
Discussion
La epidermis de la piel funciona como una barrera crítica para separar y proteger el cuerpo del ambiente exterior y el daño de la pérdida del agua, de los agentes patógenos, del calor y de la irradiación ULTRAVIOLETA. Los KC son el linaje celular predominante de la epidermis y el cultivo primario de KCs epidérmicos es una herramienta útil para estudiar y comprender los procesos biológicos de formación de barreras y la respuesta de KCs a insultos ambientales in vitro .
Aquí…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención del Instituto Nacional de Artrítis y Musculoesquelética y Enfermedades de la Piel (R01AR069653 a Zhang LJ), y los Institutos Nacionales de Apoyo a la Salud (5T32AR062496-03 a CA).
Materials
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
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