Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto
Summary
Os queratinócitos epidérmicos formam uma barreira funcional da pele e são posicionados na linha de frente da defesa do hospedeiro contra insultos ambientais externos. Aqui descrevemos métodos para isolamento e cultura primária de queratinócitos epidérmicos de pele de rato neonatal e adulta e indução de diferenciação terminal e resposta inflamatória desencadeada por UVB de queratinócitos.
Abstract
O queratinócito (KC) é o tipo de célula predominante na epiderme, a camada mais externa da pele. Os KC epidérmicos desempenham um papel crítico no fornecimento de defesa da pele ao formar uma barreira da pele intacta contra insultos ambientais, como a irradiação UVB ou patógenos, e também iniciando uma resposta inflamatória sobre esses insultos. Aqui descrevemos métodos para isolar KCs de pele de rato neonatal e de pele de rabo de rato adulto. Também descrevemos condições de cultura usando suplementos de crescimento definidos (dGS) em comparação com o soro fetal bovino chelexado (cFBS). Funcionalmente, mostramos que os KCs neonatais e adultos são altamente responsivos à alta diferenciação terminal induzida por cálcio, formação de junção apertada e estratificação. Além disso, os KCs adultos cultivados são suscetíveis à morte celular desencadeada por UVB e podem liberar grandes quantidades de TNF após a irradiação UVB. Juntos, os métodos descritos aqui serão úteis aos pesquisadores para a configuração do modelo in vitroS para estudar biologia epidérmica no rato neonatal e / ou no rato adulto.
Introduction
A pele é o maior órgão do corpo com a epiderme como a camada mais externa. A epiderme desempenha um papel crítico na formação de uma barreira epidérmica intacta para separar o corpo do meio ambiente e, assim, evita a perda de água e fornece proteção contra insultos ambientais, como alérgenos, agentes patogênicos e exposição a UVB. A epiderme desenvolve a partir de uma única camada de queratinócitos basais indiferenciados (KCs) em um epitélio estratificado de várias camadas, consistindo de uma camada basal, seguida por uma camada espinhosa, camada granular e estrato córneo. Os KCs basais, que consistem em células-tronco epidérmicas e células amplificadoras de trânsito, são proliferativos e indiferenciados. À medida que os KC basais saem do ciclo celular, as células comprometem-se a se diferenciar e migram gradualmente para a superfície da epiderme, acompanhada pela maturação das junções célula-célula e na formação de uma barreira de permeabilidade epidérmica (EPB). Os KCs na camada espinhosa expressam diferenciais iniciaisMarcadores de iões tais como queratina 10 (K10); À medida que os KCs migram para a camada granular, as células expressam marcadores de diferenciação tardia, como Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) e Involucrin (INV). No stratum corneum, os KCs se tornam corneócitos terminalmente diferenciados, que eventualmente são lançados através da descamação, à medida que novas células os substituem.
O cálcio é considerado o agente mais fisiológico na epiderme e desencadeia a diferenciação in vitro e in vivo de maneira similar. Na epiderme de pele normal, os íons de cálcio formam um "gradiente de concentração" característico, aumentando a concentração para a superfície da pele 1 , 2 , 3 . A concentração de cálcio aumenta de níveis baixos nas subcamadas mais baixas (camadas basais e espinhosas) até um pico na camada granular superior e depois cai para níveis insignificantes na camada mais superficial (estrato córneo). O gradiente de cálcio também se desenvolve coincidentemente com o surgimento de uma barreira de permeabilidade de componentes, que apóia que a sinalização de cálcio desempenha um papel crítico na diferenciação de KC. In vitro , baixo teor de cálcio (0,02-0,1 mM) mantém a proliferação de KCs basais como monocamada, enquanto que o alto teor de cálcio (> 0,1 mM) induz um comprometimento rápido e irreversível das células para a diferenciação terminal, como demonstrado pela formação e indução da junção apertada De LOR e INV após alto tratamento de cálcio com os KC basais 4 , 5 .
Além da formação de barreiras, os KC epidérmicos também são um componente importante do sistema imune inato da pele. Em resposta a patógenos ou padrões moleculares associados danificados (DAMPs) liberados após irradiação UVB ou lesões, os KCs podem produzir grandes quantidades de citocinas inflamatórias, como TNFα, IL6 e IFNβ, levando a ativação do sistema imunológico> 6 , 7 , 8 , 9 . Embora seja necessária uma sinalização inflamatória adequada de KCs para a depuração de patógenos, a resposta inflamatória descontrolada pode desencadear o desenvolvimento de doenças de pele auto-inflamatórias, como psoríase e rosácea 6 , 8 .
Em geral, os KCs desempenham um papel vital na manutenção da barreira da pele intacta e no início de uma resposta imune após invasão de patógenos ou insultos ambientais. Portanto, a cultura primária de KCs epidérmicos é uma técnica útil para estudar a biologia epitelial, a diferenciação de KC, bem como as respostas imunes inatas estimuladas por KC. O isolamento e a cultura dos KCs epidérmicos de ratos primários podem ser um processo desafiador devido à susceptibilidade e sensibilidade de KC a vários estimulantes externos. Aqui descrevemos um método para isolar e cultura KCs de pele neonatal de mouse ouPele de cauda de rato adulto. Para o isolamento KC adulto, não usamos a pele dorsal do mouse porque o isolamento de quantidades suficientes de KC viáveis deste tecido pode ser difícil pelas seguintes razões: Primeiro, a pele dorsal adulta na fase de repouso do ciclo do cabelo (telógeno) consiste em um Epiderme fina com apenas 1-2 camadas de células, levando a um baixo rendimento celular e a uma separação ineficiente da epiderme da derme, que é o passo crítico para o sucesso do isolamento de KC. Em segundo lugar, a alta densidade folicular do cabelo que está presente na pele dorsal adulta contribui ainda mais para a dificuldade em separar a epiderme da derme. Em vez disso, usamos rotineiramente a pele da cauda como fonte de KCs para ratos adultos, pois esse epitélio é mais espesso com 3-5 camadas de KC epidérmico. Também possui uma menor densidade do folículo capilar, o que não interfere na separação epidérmica, permitindo o isolamento KC de qualquer pele de rabo de rato adulto, independentemente da idade e do estágio de ciclismo do mouse. A neona isoladaKCs são semeados para pratos de cultura revestidos com gelatina, enquanto que os pratos revestidos com colágeno são utilizados para semente KC adultos isolados devido à capacidade prejudicada das células adultas para aderir em comparação com as suas contrapartes neonatais. Para cultivar KCs de ratinho, o meio basal de baixo cálcio é suplementado com dGS, que contém o fator de crescimento epidérmico (EGF), a transferrina bovina, o fator de crescimento insulino-tipo1 (IGF1), a prostaglandina E2 (PGE2), a albumina de soro bovino (BSA) e a hidrocortisona. Entre 2-4 dias após o chapeamento inicial, a maioria dos KCs diferenciados podem ser lavados durante as mudanças diárias do meio, e as células aderentes restantes apresentam morfologia típica em paralelepípedos 4 , estão proliferando e não expressam o marcador de diferenciação inicial K10.
Protocol
Representative Results
Discussion
A epiderme da pele funciona como uma barreira crítica para separar e proteger o corpo do ambiente externo e danos causados pela perda de água, patógenos, calor e radiação UV. Os KCs são a linhagem celular predominante da epiderme e a cultura primária de KC epidérmicas é uma ferramenta útil para estudar e compreender os processos biológicos de formação de barreiras e a resposta de KCs a insultos ambientais in vitro .
Aqui descrevemos métodos para isolar e cultivar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela subvenção de INSTITUTO NACIONAL DE ARTRITE E MÚSICA MUSCULOSALELÉTICA E PELE (R01AR069653 a Zhang LJ) e Institutos Nacionais de Apoio à Saúde (5T32AR062496-03 a CA).
Materials
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
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