Isolering og kultur av primære muskeratinocytter fra neonatal og voksen mus hud

Summary

Epidermal keratinocytter danner en funksjonell hudbarriere og er plassert på forsiden av vertsforsvaret mot eksterne miljøforstyrrelser. Her beskriver vi metoder for isolering og primærkultur av epidermale keratinocytter fra neonatal og voksen museskinn, og induksjon av terminal differensiering og UVB-utløst inflammatorisk respons fra keratinocytter.

Abstract

Keratinocytten (KC) er den dominerende celletypen i epidermis, det ytre laget av huden. Epidermal KCs spiller en kritisk rolle for å gi hudforsvar ved å danne en intakt hudbarriere mot miljøforstyrrelser, som UVB-bestråling eller patogener, og også ved å starte en inflammatorisk respons på disse fornærmelsene. Her beskriver vi metoder for å isolere KCs fra nyfødt museskinn og fra voksen mushale. Vi beskriver også dyrkningsbetingelser ved bruk av definerte veksttilskudd (dGS) sammenlignet med chelexed føtalt bovint serum (cFBS). Funksjonelt viser vi at både neonatal og voksne KCs er svært lydhør overfor høy kalsium-indusert terminal differensiering, stramt kryssformasjon og stratifisering. I tillegg er kultiverte voksne KCs utsatt for UVB-utløst celledød og kan frigjøre store mengder TNF ved UVB-bestråling. Sammen, vil metodene beskrevet her være nyttige for forskere for oppsett av in vitro- modellS for å studere epidermal biologi i nyfødt mus og / eller voksen mus.

Introduction

Huden er det største organet i kroppen med epidermis som det ytre mest lag. Den epidermis spiller en kritisk rolle i å danne en intakt epidermal barriere for å skille kroppen fra miljøet, og dermed forhindre vanntap og gir beskyttelse mot miljøskader, som allergener, patogener og UVB-eksponering. Den epidermis utvikler seg fra et enkelt lag av utifferentierte basal keratinocytter (KCs) til et flerskiktet stratifisert epitel som består av et basal lag, etterfulgt av et spinous lag, granulært lag og stratum corneum. Basal KCs, som består av både epidermale stamceller og transittforsterkende celler, er proliferative og utifferentierte. Etter hvert som basale KC'er forlater cellesyklusen, forplikter cellene seg til differensiering og gradvis migrere mot overflaten av epidermis, ledsaget av modning av cellekryssinger og dannelse av en epidermal permeabilitetsbarriere (EPB). KCs på spinous laget uttrykker tidlig differensiIonmarkører som Keratin 10 (K10); Når KCs migrerer til granulært lag, uttrykker cellene sen differensieringsmarkører som Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) og Involucrin (INV). På stratum corneum blir KC'ene terminalt differensierte corneocytter, som til slutt kaster av gjennom desquamation som nye celler erstatter dem.

Kalsium anses som det mest fysiologiske middel i epidermis og utløser differensiering in vitro og in vivo på en lignende måte. I normal hudepidermis danner kalsiumioner en karakteristisk "konsentrasjonsgradient", som øker i konsentrasjon mot hudoverflaten ^{1 , 2 , 3} . Kalsiumkonsentrasjonen stiger fra lave nivåer i de laveste underlagene (basale og spinøse lag) til en topp i det øvre granulære lag og faller deretter til ubetydelige nivåer i det mest overfladiske laget (stratum corneum). Kalsiumgradienten utvikler også tilfeldigvis med fremveksten av en komponentpermeabilitetsbarriere, som støtter at kalsiumsignaler spiller en kritisk rolle for KC-differensiering. In vitro opprettholder lavt kalsium (0,02-0,1 mM) proliferasjonen av basale KC som et monosjikt, mens høyt kalsium (> 0,1 mM) induserer en rask og irreversibel forpliktelse av cellene til terminal differensiering som demonstrert ved tett sammenkoblingsdannelse og induksjon Av LOR og INV på høy kalsiumbehandling til basale KCs ^{4 , 5} .

I tillegg til barriereformasjon er epidermal KC også en viktig komponent i hudens medfødte immunsystem. Som respons på patogener eller skadede assosierte molekylære mønstre (DAMP) som frigjøres ved UVB-bestråling eller skade, kan KCs produsere store mengder inflammatoriske cytokiner, slik som TNFa, IL6 og IFNβ, som fører til immunsystemaktivering> 6 ^{, 7 , 8 , 9} . Selv om riktig inflammatorisk signalering fra KC er nødvendig for patogener, kan ukontrollert inflammatorisk respons utløse utviklingen av autoinflammatoriske hudsykdommer, som psoriasis og rosacea ^{6 , 8} .

Samlet sett spiller KCs en viktig rolle i å opprettholde den intakte hudbarrieren og initierer en immunrespons ved patogen invasjon eller miljøkamp. Derfor er primærkultur av epidermale KCer en nyttig teknikk for å studere epitelbiologi, KC-differensiering, samt KC-stimulerte medfødte immunresponser. Isolering og kultur av primære musepidermuskulære KC kan være en utfordrende prosess på grunn av KCs følsomhet og følsomhet over for ulike eksterne stimulanser. Her beskriver vi en metode for å isolere og dyrke KCer fra enten neonatal museskinn ellerVoksen mus hale hud. For KC-isolasjon av voksne bruker vi ikke musens dorsale hud, fordi isolering av tilstrekkelige mengder levedyktige KCer fra dette vevet kan være vanskelig av følgende grunner: Først består den voksne dorsale huden i hvilepasen av hårsyklusen (telogen) av en Tynn epidermis med kun 1-2 lag celler, som fører til lav celleutbytte og ineffektiv separering av epidermis fra dermis, som er det kritiske trinnet for vellykket KC-isolasjon. For det andre bidrar den høye hårfollikeltettheten som er tilstede på voksen dorsal hud, ytterligere til vanskeligheten ved å separere epidermis fra dermis. I stedet bruker vi rygghud som kilden for voksne mus-KC, da dette epitelet er tykkere med 3-5 lag epidermal KCs. Det har også en lavere hårfollikkel tetthet, noe som ikke forstyrrer epidermiseparasjonen, slik at KC-isolasjon fra hvilken som helst voksen musestik hud, uavhengig av alder og hårsyklusstadiet av musen. Den isolerte neonaenTal-KCs blir podet til gelatin-belagte kulturretter, mens kollagenbelagte retter brukes til frø isolerte voksne KCs på grunn av den svekkede evne hos de voksne cellene til å kle seg i forhold til deres neonatale kolleger. For å dyrke mus-KC-er, blir lavt kalsiumbasalt medium tilsatt dGS, som inneholder epidermal vekstfaktor (EGF), bovint transferrin, insulinlignende vekstfaktor1 (IGF1), prostaglandin E2 (PGE2), bovint serumalbumin (BSA) og hydrokortison. Mellom 2-4 dager etter den første plating, kan de fleste differensierte KCs vaskes bort under daglige mediumendringer, og de resterende vedhengende celler viser typisk brostenmorfologi ⁴ , prolifererer og uttrykker ikke den tidlige differensieringsmarkør K10.

Protocol

Alle dyreforsøk er godkjent av UCSD Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Primær mus KC-isolasjon og kultur fra neonatal hud Offer de postnatala dagene 0-2 nyfødte fra C57B / 6 wildtype musestammen ved å avtappe med saks. Kutt av lemmer rett over håndleddet og ankelleddene, så kutt av halen helt, og la et lite hull. For å fjerne hele huden, sett først skarpe saks gjennom hullet på halen og kutt huden langs dorsal midtlinjen av kroppen til åpni…

Representative Results

Kalsium indusert terminal differensiering av neonatal og voksen KCs. Den primære mus epidermale KCs belagt og holdt ved 0,06 mM CaCl2 vokste som et monolag, og individuelle celler hadde en polygonal form med forskjellig mellomrom mellom, som viser en brostein utseende når sammenflytende (figur 1A og figur 2A). Heve CaCl 2 til 0,2 mM induserte en hurtig morfologi endring av cellene. Innen …

Discussion

Hudens epidermis fungerer som en kritisk barriere for å skille og beskytte kroppen mot utemiljøet og skade fra vanntap, patogener, varme og UV-bestråling. KC er den dominerende cellelinjen til epidermis, og primærkultur av epidermale KC er et nyttig verktøy for å studere og forstå de biologiske prosessene for barriereformasjon og KCs respons på miljøbelastninger in vitro .

Her beskriver vi metoder for å isolere og dyrke primære epidermale KCer fra neonatal og voksen muses…

Materials

C57BL/6 neonates or adult wildtype mice	Jackson Laboratory	000664	Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD.
KC basal medium (EpiLife)	Invitrogen, Carlsbad, CA	MEPICF500	basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2
Defined Growth Supplement (dGS)	Invitrogen, Carlsbad, CA	S0125	defined growth supplements for culture medium
Dispase powder	Invitrogen, Carlsbad, CA	17105041	enzyme to dissociate the epidermis from dermis
Attachment Factor	Invitrogen, Carlsbad, CA	S006100	gelatin-based coating material
Coating Matrix	Invitrogen, Carlsbad, CA	R011K	Collagen-based coating material
TrypLE	Invitrogen, Carlsbad, CA	12604-013	A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet
100 μm Cell Strainer Nylon mesh	Corning	352360
CCK-8 cell viability Kit	Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD	CK04-11
Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II	BD Biosciences, San Jose, CA	555268
Corded Hand-Held UV Lamps	Spectronics, Westbury, NY	EB-280C
8-watt UV tubes	Spectronics, Westbury, NY	BLE-8T312
Light Inverted Microscope for cell culture	ZEISS, Jena, Germany	Axio Observer
Fluorescent Microscope	Olympus	BX41